S100A4/Mts1在低氧诱导肺动脉平滑肌增殖中的作用机制

李运成 刘 婷 贺斌峰 王关嵩

S100A4，又被称作Mts1，是S100蛋白家族的成员之一。研究发现S100至少包含25种蛋白，除了S100G以外，其他均为Ca2+结合蛋白。他们参与Ca2+信号传导，并通过钙离子信号传导途径作用于靶蛋白改变其活性，在细胞增殖、分化等过程中发挥重要作用。最近研究表明S100A4/Mts1基因不仅参与肿瘤的增殖、转移和侵袭，而且可促进肺动脉平滑肌(pulmonary arterial smooth muscle cells，PASMCs)的增殖、迁移，但其作用机制尚不明确［1-2］。本研究旨在对S100A4在低氧刺激肺动脉平滑肌增殖中的作用机制进行初步探讨。

材料与方法

一、主要试剂

SD大鼠由重庆市动物实验中心提供，胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)、低糖DMEM培养基、胰酶均购自美国GIBCO公司;p-JAK2(#9134)兔抗鼠单克隆抗体、p-STAT3(#38167)兔抗鼠单克隆抗体购于美国Scien Cell公司;S100A4(#ab27957)兔抗鼠单克隆抗体购于Abcam公司;辣根酶标记山羊抗兔IgG(H+L)购自北京华肽先锋生物公司(#40116);AG490购自武汉博士德公司;细胞裂解液、ECL化学发光试剂盒均购自PIERCE公司(#78503、#1856135);生物素标记山羊抗兔IgG(H+L)、DAPI购自江苏碧云天科技有限公司(#A0277、#C1005)

二、方法

1.大鼠肺动脉平滑肌细胞(pulmonary arterial smooth muscle cells，PASMCs)细胞分离及培养:PASMCs从雄性SD大鼠肺动脉中分离得到，方法参照文献［3］。分离出的PASMCs在含10%的胎牛血清的低糖DMEM中于37℃、饱和湿度下5%CO2的培养箱中传代培养，取对数生长期的细胞进行实验。

2.大鼠PASMCs细胞的低氧刺激:取4瓶对数期生长、融合度95%以上的细胞，分为低氧组和干预组，吸出原有培养基，加入4 ml 0.1%FBS低糖DMEM培养基中常氧培养24 h，干预组在放入低氧环境前45 min加入30μM AG490(30μl)，低氧组加入等量生理盐水，这两组细胞放入在0.3%O2、5%CO2、94.7%N2低氧环境中分别培养0 h、8 h。

3.免疫荧光:用0.01M PBS洗涤各组细胞后，加入4%多聚甲醛覆盖2～3 mim，室温固定15 min，吸出固定液，PBS洗涤3次，每次5 min，冰冻10%甲醇覆盖细胞3～5 mim，孵育10 min，冰冻PBS冲洗5 min，3%BSA(tritionin稀释)封闭60 min，吸出封闭液，加入 S100A4兔抗鼠单克隆抗体(1︰50，购自Abcam)工作液，4℃过夜，PBS洗涤3次，每次5 min，室温避光孵育2抗(生物素标记的二抗为羊抗兔多克隆抗体，购自武汉博士德公司，工作浓度1︰200)1～2 h，PBS洗涤3次，每次5 min，加入 DAPI(1︰1000，购自碧云天)，避光封闭1 h，PBS洗涤3次，每次5 min，封片，使用激光共聚焦显微镜进行检测。

四、Western blot检测

1.S100A4蛋白的表达检测:收集低氧组刺激0 h、8 h和低氧干预组细胞，加裂解液提取总蛋白，加5X Loading buffer，煮沸5 min变性。配制15%分离胶、5%浓缩胶后进行SDS-PAGE凝胶电泳，300 mA湿转25 min，将PVDF膜置于5%脱脂奶粉室温封闭1 h，用TBST洗膜10 min，加入5%脱脂奶粉稀释的S100A4一抗(1︰1000)中4℃孵育过夜，次日TBST漂洗3次，每次5 min，放入5℅脱脂奶粉稀释的辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG(1︰1000)抗体中室温孵育1 h，TBST漂洗3次，每次5 min，ECL化学发光法显色。以GAPDH内参蛋白进行校正。

2.p-JAK2蛋白的表达检测:收集干预组和对照组低氧刺激0 h、8 h的细胞，加裂解液提取总蛋白，加5X Loading buffer煮沸5 min变性。配制8%分离胶、5%浓缩胶后进行SDS-PAGE凝胶电泳，300 mA湿转2.5 h。将PVDF膜置于5%脱脂奶粉室温封闭1 h，用TBST洗膜10 min，加入5%BSA稀释的p-JAK2一抗(1︰1000)中4℃孵育过夜，余步骤同前。

3.p-STAT3蛋白的表达检测:收集各组的蛋白，变性后，配制10%分离胶、5%浓缩胶后进行SDSPAGE凝胶电泳，300 mA湿转1.5 h，将PVDF膜置于5%脱脂奶粉室温封闭1 h，用TBST洗膜10 min，加入5%BSA稀释的p-STAT3一抗(1︰1000)中4℃孵育过夜，余步骤同前。

五、统计学处理

使用Image-Pro Plus 10.0对图像进行分析，使用SPSS 13.0 for windows对数据进行分析，各实验至少重复3次，两组均数间比较用配对t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、免疫荧光

低氧0 h S100A4/Mtsl在胞浆中少量表达，低氧刺激8 h后胞浆及胞核中明显表达，见图1。

图1 低氧刺激PASMCs 0 h及8 h组S100A4的表达

二、Western blot检测

1.S100A4/Mtsl蛋白在低氧刺激8 h比低氧刺激0 h表达明显升高(P＜0.05)，AG490干预低氧刺激8 h组S100A4/Mtsl蛋白的表达较低氧刺激8 h组显著下降(P＜0.05)，见图2。

图2 S100A4/Mtsl蛋白的表达

2.p-JAK2蛋白在低氧刺激8 h比低氧刺激0 h表达明显升高(P＜0.05)，AG490干预低氧刺激8 h组三种蛋白的表达较低氧刺激8 h组显著下降(P＜0.05)，见图3。

图3 p-JAK2蛋白的表达

3.p-STAT3蛋白在低氧刺激8 h比低氧刺激0 h表达明显升高(P＜0.05)，AG490干预低氧刺激8 h组三种蛋白的表达较低氧刺激8 h组显著下降(P＜0.05)，见图4。

图4 p-JAK2蛋白的表达

讨 论

S100A4是一种EF-手型钙结合蛋白，通过对钙离子的调节及与靶蛋白的相互作用。在体内发挥多种生物学作用，参与细胞周期活动、细胞分化、肿瘤生长以及细胞外基质分泌活动等过程［1］。近年来的研究表明S100A4在肿瘤中呈高表达，并通过影响细胞骨架重排等作用机制来影响肿瘤的转移机制［4-6］。本研究发现在低氧刺激下S100A4在胞浆和胞核中的表达比常氧下明显升高，S100A4蛋白表达显著高于常氧组，其他的研究也支持上述结论［7-8］。这表明低氧可对S100A4基因进行调控。同时在低氧刺激下PAMSC细胞也从合成型转变为分泌型，细胞开始增殖［3］。提示S100A4与PMASC的增殖有着密切的关系，与文献报道一致［2］。

JANUs激酶(januskinase，JAK)家族属于胞浆部分的蛋白酪氨酸激酶，是作为受体和最终效应分子之间的介导分子，主要参与细胞因子受体介导的信号转导［9-10］。信号转导和转录激活子(signal transducers and acti 2 vator of transcrip tions，STATs)是一类能与靶基因调控区DNA结合的胞质蛋白，是JAKs的下游底物。JAK-STAT通路广泛参与细胞的增殖、分化、应激、凋亡、炎症反应和免疫调节等［11］过程，此通路能够将信号迅速由细胞外传递至细胞内，并进入核内启动RNA转录和蛋白翻译。研究表明低氧刺激可激活多种细胞中的JAK-STAT信号通路［12-14］。本研究中RPAMSC在低氧8 h组p-JAK2、p-STAT3蛋白表达明显高于常氧组，有显著性差异，与文献报道一致［12-13］。许多研究表明JAKs或/和STATs在低氧或氧化应激作用下被激活，提示STATs的磷酸化对低氧或氧化应激环境中的细胞起调节作用［15］。AG490是可与受体酪氨酸激酶竞争结合位置，特异性阻滞各种细胞因子引起的JAK2和下游分子STAT3的的磷酸化激活，从而阻断JAK-STAT信号通路。结果中AG490干预组较低氧8 h组p-JAK2、p-STAT3的蛋白表达显著降低，与Wang等［13］的结果一致。

我们的结果显示在AG490的干预下，S100A4蛋白的表达比单纯低氧组有显著的降低。低氧调控S100A4表达的分子机制目前尚不清楚，低氧诱导的关键性分子事件是Hif-1(hypoxia induced factor 1)的激活，Hif-1是由Hif-1α和Hif-1β组成的异源二聚体，与低氧反应元件(hypoxia responsive element，HRE)结合后激活靶基因如VEGF、EPO、Glut1等转录［16］。有研究表明在S100A4基因的第一个启动子中含有HRE，Hif-1-1α可通过与HRE的结合来激活S100A4基因的转录［8，17］。Xu等［18］阐明了在肾母细胞瘤中STAT3能够调节AKt的表达，进而上调生长因子诱导的HIF-1的高表达。他们在体外实验中，以小分子抑制剂作用于STAT3实现了阻断HIF-1的表达。提示AG490可能通过抑制JAK2-STAT3信号通路，间接影响了S100A4的表达。

综上所述，PAMSC在低氧刺激下S100A4蛋白的表达增高，提示S100A4在PAMSC的增殖中起重要的作用，进一步揭示低氧肺动脉高压的形成机制。同时AG490可间接抑制S100A4的表达，提示AG490可用于减缓肺动脉高压的发病进程。

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