正交实验法优选清肺平喘颗粒的提取工艺

2012-07-26李玉平黎晓敏

饲料博览 2012年7期

李玉平，张利，黎晓敏*

（1.西南大学动物科技学院，重庆 400715；2.重庆市兽药工程技术研究中心，重庆 400716）

近年来，畜禽生产中越来越多的疾病都伴随气喘的症状，气喘可引起畜禽的抵抗力下降，从而引发多种疾病，同时使生产性能下降，经济效益降低，给养殖业造成重大经济损失。为了减少化学药物的药物残留，保障食品安全，应该加强对中兽药制剂的研发和应用。目前，我国中兽药制剂工艺比较落后，大多数成方制剂仍以散剂为主，有效成分不能合理应用。颗粒剂既能够保持中医药的传统用药特色，又能最大限度地提取和保留处方中药物的有效成分，发挥有效成分的综合治疗作用，确保临床疗效。同时，颗粒剂性质稳定，服用、携带、储藏、运输均较方便。

清肺平喘颗粒的方剂由板蓝根、浙贝母、甘草、葶苈子、桔梗组成，具有清肺平喘，止咳化痰的功效[1]。为了发挥药物的最佳疗效，也便于生产中的临床给药，进而优化制备工艺。试验对组方进行分析，根据各味药材所含成分的性质，拟分水溶和醇溶两组提取。本试验以甘草酸和贝母素甲的含量及其所得浸膏率为考察指标，采用正交实验设计，对各自提取工艺进行优化，选取最佳提取工艺。

1 仪器与试药

1.1 仪器

HH-S6数显恒温水浴锅由金坛市医疗仪器厂生产，旋转蒸发仪由德国海道夫公司生产，Waters高效液相色谱仪、蒸发光散射检测器、紫外检测器由美国Waters公司生产，KQ-600DA数控超声波清洗器型由昆山市超生仪器有限公司生产。

1.2 试剂

贝母素甲、甘草酸铵标准品购自中国药品生物制品检定所；甲醇、乙腈均为色谱纯，其他试剂均为分析纯；药材均购自重庆市桐君阁大药房，经鉴定均符合2010年版《中国兽药典（一部）》规定。

2 试验方法

2.1 醇提工艺条件的研究

2.1.1 正交实验设计

根据浙贝母、葶苈子、桔梗所含成分的性质及参考有关文献，确定乙醇用量（A）、提取时间（B）、乙醇浓度（C）、提取次数（D）4个因素，选择3个水平进行试验考察，采用正交设计试验L9（34）表进行试验，因素水平见表1。

表1 醇提法因素水平

2.1.2 提取方法

按照处方比例称取浙贝母、葶苈子、桔梗药材各9份，按正交表设计进行提取，合并提取液，过滤，60℃下旋转浓缩至50 mL，作为贮备液。以贝母素甲的含量和出膏率作为指标进行直观分析和方差分析，优化醇提工艺。

2.1.3 浸膏得率的测定

精密吸取提取液25 mL，置干燥至恒重的蒸发皿中，水浴蒸干后，105℃干燥3 h，取出，置干燥器内冷却30 min，精密称重，计算出膏率。

2.1.4 贝母素甲的含量测定

色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-水-二乙胺（70∶30∶0.3）为流动相，蒸发光散射检测器。理论板数按贝母素甲峰计算应≥2 000。蒸发光散射检测器参数：漂移管温度为85.5℃，载气流速为2.2 L·min-1。流速为1.0 mL·min-1，柱温为30℃。

对照品溶液的制备：准确称取贝母素甲对照品2.0 mg，甲醇溶解，定容至10 mL，得到浓度为0.2 mg·mL-1对照品溶液。

供试品溶液的制备：精密量取对照品溶液约5 mL，置烧瓶中，加浓氨溶液1 mL浸润1 h，精密加入三氯甲烷-甲醇（4∶1）的混合溶液10 mL，称重，混匀，置80℃水浴中加热回流2 h，放冷，再称重，加对照品溶液补足减失的重量，过滤。将续滤液置蒸发皿中蒸干（60℃），用甲醇定容至2 mL，摇匀，即得供试品溶液。

标准曲线的绘制：精密称取贝母素甲对照品10.20 mg，置10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，即制成含贝母素甲1.02 mg·mL-1。分别吸取溶液0.2、0.4、0.8、1.6、3.0 mL至10 mL容量瓶中，用甲醇配制成系列浓度溶液。精密吸取各溶液10 μL，注入液相色谱仪，记录峰面积[2-4]。以峰面积的自然对数值为纵坐标，贝母素甲进样量的自然对数值为横坐标，作直线回归，得回归方程为：Y=1.3663X+8.1504，r=0.9996，结果表明，贝母素甲含量为0.204～3.06 μg，线性关系良好。

含量测定：精密吸取对照品溶液和样品溶液各10 μL，按上述色谱条件，注入高效液相色谱仪，测定。

2.1.5 验证试验

取3份样品，采用加醇量12倍、80%的乙醇浓度进行提取，时间为1.5 h，提取2次，测定贝母素甲的含量。

2.2 水提工艺条件的研究

2.2.1 正交实验设计

将上述醇提取后的药物残渣和板蓝根、甘草水煎提取，确定加水量（A）、提取时间（B）、提取次数（C）3个因素，选择了3个水平进行试验考察，采用正交设计试验L9（34）表进行试验，因素水平见表2。

图1 贝母素甲对照品溶液HPLC结果

表2 水煎煮法因素水平

2.2.2 提取方法

按照处方比例称取板蓝根和甘草药材共9份，按正交表设计进行提取，合并提取液，滤过，60℃下旋转浓缩至50 mL，作为贮备液。以甘草酸含量和出膏率作为指标进行直观分析，优化水提工艺。

2.2.3 浸膏得率的测定

精密吸取提取液25 mL，置干燥至恒重的蒸发皿中，水浴蒸干后，105℃干燥3 h，取出，置干燥器内冷却30 min，精密称重，计算出膏率。

2.2.4 甘草酸的含量测定

色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇-0.2 mol·L-1醋酸铵溶液-冰醋酸（66∶33∶1）为流动相；检测波长为250 nm。理论板数按甘草酸峰计算应≥2 000。

对照品溶液的制备：精密称取甘草酸铵对照品约1.0 mg，置25 mL容量瓶中，流动相稀释并定容至刻度，即得（每1 mL含甘草酸单铵盐对照品40 μg，折合甘草酸为39.18 μg）。

供试品溶液的制备：精密量取贮备液约2 mL，置25 mL容量瓶中，加流动相至刻度，超声处理（功率100 W，频率20 kHz）60 min，取出，放冷，补足减失的重量，摇匀，过滤，取续滤液，即得备用。

标准曲线绘制：精密量取甘草酸铵适量，置25 mL的容量瓶中，用流动相稀释并定容至刻度，配制浓度为80.0 μg·mL-1的对照品溶液。分别吸取贮备液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL置于10 mL容量瓶中，用流动相稀释至刻度，按上述色谱条件，分别依次进样，进样量10 μL，测定峰面积[5-7]。对峰面积（Y）对其浓度（X）进行线性回归，得回归方程为Y=8538.4X－4395.7,r=0.99994。结果表明，甘草酸含量为7.84～78.36 μg·mL-1呈良好的线性关系。

含量测定：精密吸取对照品溶液和样品溶液各10 μL，按上述色谱条件，注入高效液相色谱仪，测定。

图2 甘草酸铵标准品HPLC结果

2.2.5 验证试验

取3份样品，加水量10倍进行煎煮，时间为1.5 h，提取2次，测定甘草酸含量。

3 试验结果

3.1 醇提法提取工艺结果

醇提法提取工艺结果见表3～5。

表3 醇提法提取工艺正交实验

表4 醇提法浸膏得率方差分析

表5 醇提法贝母素甲含量方差分析

从正交实验结果来看，对浸膏得率影响大小依次为D＞A＞B＞C，直观分析结果表明最佳提取工艺为A3B2C1D3；对贝母素甲含量的影响主次顺序为D＞C＞A＞B，直观分析结果表明最佳提取工艺为A3B2C3D2;方差分析结果来看，提取次数对干膏得率和贝母素含量的影响显著，加醇量和提取时间对浸膏得率有影响，提取浓度对含量影响显著。从实际出发，综合分析，选择的最佳提取工艺为A3B1C3D2，即为加醇量12倍，提取1.5 h，乙醇浓度为80%，提取2次。

3.2 醇提取法验证试验

出膏率分别为14.5%、15.0%和14.2%，贝母素甲含量为 50.5、47.7、45.6 μg·mL-1，则进一步证明，该工艺稳定、可行，可作为最佳提取工艺。

3.3 水提法提取工艺结果

水提法提取工艺结果见表6～8。

表6 水提法正交实验

表7 水提法浸膏得率方差分析

表8 水提法甘草酸含量方差分析

由表6～8可知，对浸膏得率影响顺序为C＞B＞A，直观分析结果表明最佳提取工艺为A1B3C3；3个因素中，提取次数对浸膏得率有显著影响；对甘草酸含量的影响主次顺序为C＞A＞B，3个因素对甘草酸含量影响都不显著；直观分析结果表明，最佳提取工艺为A2B2C3；从实际出发，综合分析选择的最佳提取工艺为A2B3C3，即加水量10倍，提取1.5 h，提取3次。

3.4 水提法验证试验

出膏率为26.40%、24.88%和26.24%，甘草酸含量为31.42、30.62和32.42 ug·mL-1。结果进一步证明，该工艺稳定、可行，可作为最佳提取工艺。

4 讨论

中兽药在治疗哮喘方面有独特的优势，其具有作用靶点多、副作用小、疗效确切等优点。目前，大多数中兽药制剂多以散剂为主，制作粗糙，服用量大，不利于畜禽的吸收，而制成颗粒剂，使起主要作用的有效成分浓度增高，进而增强了其药效；溶解释放迅速、起效快，便于动物吸收；给药途径上，颗粒剂既可饮水，也可混饲，克服了中兽药散剂必须通过混饲的方式给药的缺陷；颗粒剂中添加了矫味剂，克服了某些中药的苦味，口感好，动物服用方便；颗粒剂性质稳定，质量可控，适于工业化生产；制成颗粒剂后，体积重量远比散剂小的多，服用、携带、储藏、运输均较方便。

清肺平喘颗粒为复方制剂，成分复杂。提取时需根据处方中各药材多含有效成分的性质进行选择。浙贝母主要有效成分是贝母素甲、贝母素乙等甾体生物碱，在乙醇中的溶解度大。而葶苈子主要含槲皮素、山奈酚等，为基本苷元的黄酮苷类成分，易溶于甲醇、乙醇等有机溶剂。桔梗的主要活性成分桔梗皂苷也易溶于乙醇，同时有关研究表明，采用醇提法提取效率高，故采用乙醇回流提取[8-9]。甘草所含有效成分甘草酸、甘草次酸等水溶性强，有报道指出，将甘草和板蓝根同以上药渣共水煎煮进行提取可提高提取率[10-11]。

正交实验中有效成分含量的选择需根据药材中止咳平喘药效较强的主要活性成分以及药典中含量测定方法的标准来确定，故选择贝母素甲、甘草酸的含量作为评价的指标。但是复方中成分复杂，仅仅靠单指标评价有一定的局限性，故选择出膏率和有效成分的含量共同作为评价指标，可综合评价工艺的合理性。