不同商品等级羌活中有机酸和香豆素类化合物的测定

2012-07-26刘卫根王亮生徐文华杨路存朱满兰周国英

中成药 2012年11期

刘卫根，王亮生，徐文华，杨路存，朱满兰，周国英*

(1.中国科学院高原生物适应与进化重点实验室，青海西宁810008;2.中国科学院植物研究所，北京100093;3.中国科学院研究生院，北京100049;4.南京农业大学，江苏南京210095)

羌活原植物为伞形科羌活属植物羌活Notopterygium incisum Ting ex H.T.Chang和宽叶羌活Notopterygium franchetii H.de Boiss.，以其干燥根茎和根入药［1］。羌活属 Notopterygium为中国特有属，隶属于伞形科Umbelliferae，该属包括5个种1个亚种［2-3］。按吴征镒先生中国植物区系分区，羌活属植物主要分布于中国—喜马拉雅植物亚区的横断山脉地区、中国—日本森林植物亚区的黄土高原地区和青藏高原的唐古特地区［4］。

羌活不仅是羌医药体系中的重要药材，而且在中、藏医药体系中也具有悠久的药用历史。药理研究表明，羌活具有抗炎、镇痛、散寒、祛风、除湿等多种功效，对心血管疾病、消化系统疾病也具有一定的疗效［5］。挥发油、香豆素和有机酸类化合物是羌活中最主要的3大类活性成分，它们具有广泛的生物活性，如绿原酸具有利尿抗炎等作用［6］，阿魏酸具有抗炎、抗氧化、抗凝、抗血小板聚集、扩张微血管、增加冠脉流量、解除血管痉挛、防止血压升高等作用［7-8］，羌活醇和紫花前胡苷具有镇痛、抗炎等作用［9-10］，这些活性成分的存在使得羌活具有独特的药效，因而应用广泛。

羌活药材商品规格按产地不同分为川羌 (四川)和西羌 (甘肃、青海等);依据药材性状一般划分为蚕羌、竹节羌、大头羌和条羌4个商品等级［1，11］，其中上部根茎粗壮，节密，呈紧密隆起的环状，全体圆柱略弯曲，形如蚕状者为蚕羌;节间延长，形如竹节状，习称竹节羌;有的根茎粗大，不规则结节状，顶部具数个茎基，根较细，习称大头羌;一般认为蚕羌的质量最优，竹节羌次之，大头羌、条羌最次。然而，这种等级划分方法仅仅依靠其外部特征，而缺乏可靠的化学以及药理学证据。本研究对不同商品等级野生羌活 (蚕羌、竹节羌、大头羌、条羌)以及断离的支根、细根(须根)中主要的有机酸和香豆素类化合物进行了测定和比较，从化学角度探讨羌活药材传统商品等级划分的科学合理性，为其行业标准的制定提供实验依据，对规范和提高羌活药材生产质量以及更有效地利用羌活药材具有重要意义。

1 仪器和试药

1.1 仪器戴安 (Dionex)HPLC-DAD分析系统，包括P680泵、UltiMate 3000自动进样器、TCC—100柱温箱、PDA—100光电二极管阵列检测器以及Chromeleon(6.60版本)变色龙色谱工作站。

1.2 试药有机溶剂包括分析纯甲醇、冰醋酸 (北京化工厂，中国);色谱纯甲醇和乙腈 (MREDA TECHNOLOGY INC.，USA)，HPLC 级超纯水由Milli-Q 超纯水系统 (Millipore，Billerica，MA，USA)制备。对照品阿魏酸 (批号:110773-201012)和欧前胡素 (批号:110826-201013)购自中国食品药品检定研究院;补骨脂素 (批号:110322)和佛手柑内酯 (批号:110215)购自上海顺勃生物工程有限公司;绿原酸 (批号:ps08072303)、紫花前胡苷 (批号:ps11032301)、异欧前胡素 (批号:ps08040301)、羌活醇 (批号ps11050601)购自成都普斯生物科技有限公司，各对照品纯度均在98%以上。羌活药材于2010年8月采自青海省班玛县，经中国科学院西北高原生物研究所周国英副研究员鉴定为伞形科植物羌活Notopterygium incisum Ting ex H.T.Chang。将采回的药材除去泥沙，自然阴干后，根据药典所描述方法进行不同商品等级归类，并将断离的细根、须根单独归为一类进行研究。

2 方法与结果

2.1 色谱条件色谱柱为C18TSK gel ODS-80Ts QA(250 mm × 4.6 mm，5 μm，Tosoh Co.Ltd.，日本)。体积流量0.6 mL/min，进样量10 μL。流动相A相为纯甲醇，B相为0.3%的冰醋酸水溶液，梯度洗脱程序为:0～15 min，25% ～38%A;15～17 min，38% ～38%A;17～45 min，38% ～50%A;45～55 min，50% ～75%A;55`70 min，75% ～85%A;70～75 min，85% ～25%A，75～80 min，25% ～25%A。柱温30℃;检测波长336 nm(紫花前胡苷)，325 nm(绿原酸和阿魏酸)，310 nm(佛手柑内酯、羌活醇、异欧前胡素、欧前胡素)，295 nm(补骨脂素)。混合对照品的色谱图见图1，样品的色谱图见图2和图3。

2.2 对照品溶液的制备精密称取对照品绿原酸、阿魏酸、紫花前胡苷、补骨脂素、佛手柑内酯、欧前胡素、羌活醇、异欧前胡素各适量，以甲醇溶解，摇匀并定容，制成含绿原酸 (408.00 μg/mL)、阿魏酸 (400.00 μg/mL)、紫花前胡苷(400.00 μg/mL)、补骨脂素 (405.00 μg/mL)、佛手柑内酯 (404.00 μg/mL)、欧前胡素 (403.00 μg/mL)、羌活醇 (400.00 μg/mL)和异欧前胡素(400.00 μg/mL)的混合对照品贮备液。

图1 混合对照品的高效液相色谱图 (325 nm)Fig.1 HPLC chromatograms of eight reference substances at 325 nm

图2 不同波长下蚕羌的高效液相色谱图Fig.2 HPLC chromatograms of silkworm Notopterygium under different wavelengths

2.3 供试品溶液的制备参考《中国药典》并结合文献［12-13］，选择以下提取条件:精密称取羌活粉末 (过100目筛)0.4 g，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，称定质量，超声处理 (功率250 W，频率50 kHz)30 min，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，过0.45 μm微孔滤膜，即得。

图3325 nm波长下蚕羌 (B)、竹节羌 (C)、大头羌(D)、条羌 (E)和须根 (F)的高效液相色谱图Fig.3 HPLC chromatograms of silkworm Notopterygium(B)，bamboo Notopterygium(C)，irregularnodal Notopterygium(D)，striped Notopterygium(E)and fibrous roots(F)at 325 nm

2.4 线性关系考察精密量取2.2项下的混合对照品母液5、2.5、2 mL，分别置10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，然后采用逐级稀释的方法，用甲醇将上述不同浓度的混标 (包括母液)分别稀释10n倍 (n=1，2，3)，得到一系列不同浓度的混合对照品溶液。每个浓度平行进样3针，进样量为10 μL，以对照品浓度 (X)为横坐标，平均峰面积 (Y)为纵坐标，绘制标准曲线，得到各对照品的回归方程。以逐步稀释法测得8个成分的检测限LOD值 (S/N=3)和定量限LOQ值 (S/N=10)，结果见表1。结果表明，各对照品在对应的进样浓度 (进样量)范围内，线性关系良好。

2.5 精密度试验分别在1 d内和连续5 d精密吸取同一混合对照品溶液10 μL，在所确定的HPLC条件下重复进样5次测定。记录各成分色谱峰面积，计算各对照品的浓度。结果表明，混合对照品溶液中，绿原酸、阿魏酸、紫花前胡苷、补骨脂素、佛手柑内酯、欧前胡素、羌活醇、异欧前胡素浓度的日内RSD分别为1.62%、0.49%、3.39%、0.27%、0.12%、3.33%、0.34%、1.05%，日间 RSD分别为 2.18%、0.61%、2.14%、1.96%、0.45%、1.24%、1.72%、1.98%。

2.6 稳定性试验精密吸取上述混合对照品溶液10 μL，分别在0、2、4、8、16、24 h 进样分析，根据峰面积计算混合对照品溶液中绿原酸、阿魏酸、紫花前胡苷、补骨脂素、佛手柑内酯、欧前胡素、羌活醇和异欧前胡素的浓度，RSD分别为1.97%、0.52%、1.86%、1.71%、0.64%、2.22%、1.01%、1.51%，表明24 h内8个对照品稳定性良好。

表1 8个活性成分的回归方程、检测限和定量限Tab.1 Regression equations，LODs and LOQs for eight standards

2.7 重复性试验分别称取6份蚕羌样品，各约0.4 g，精密称定，制备供试品溶液，并进行测定，结果表明，绿原酸、阿魏酸、紫花前胡苷、佛手柑内酯、羌活醇、异欧前胡素6次测定值的RSD分别为2.36%、2.17%、3.19%、1.78%、1.32%、1.56%。

2.8 加样回收率试验精密称取蚕羌样品粉末0.1 g，分别精密加入已知量高、中、低3个质量浓度的对照品溶液，按供试品溶液制备方法进行操作，并按2.1项色谱条件进样分析，计算回收率，结果如表2所示。

表2 加样回收率试验Tab.2 Recovery of the eight bioactive compounds

2.9 样品测定精密称取不同等级羌活样品各0.4 g，按2.3项方法制备供试液，按照2.1项下色谱条件注入液相色谱仪，每批平行测定3次，以外标法用峰面积积分值计算羌活药材中主要成分的含有量，结果见表3。

从表3可以看出，蚕羌、竹节羌、大头羌、条羌、须根中，绿原酸的含有量呈现下降趋势;对于阿魏酸，除竹节羌中阿魏酸含有量略低于大头羌外，由蚕羌到须根总体也呈现下降趋势;绿原酸和阿魏酸二者含有量之和也呈现下降趋势，这说明所测有机酸的含有量与其传统等级划分方法基本相符，根茎 (蚕羌、竹节羌、大头羌)中的含有量高于根 (条羌、须根)。

表3 不同商品等级羌活中主要有机酸和香豆素类化合物的比较Tab.3 Comparation of the contents of the main organic acids and coumarin compounds in different commercial parts of Notopterygium incisum

紫花前胡苷含有量最高的为条羌，其次为须根，由高到底依次为条羌＞须根＞竹节羌＞大头羌＞蚕羌。佛手柑内酯含有量最高的为须根，其次为大头羌，由高到低为须根＞大头羌＞条羌＞蚕羌＞竹节羌。羌活醇和异欧前胡素含有量最高的均为须根，其次为条羌。这说明，根 (须根、条羌)中这几种常见的香豆素类化合物的含有量反而比根茎(大头羌、竹节羌、蚕羌)中的含有量高，特别是羌活中主要的2种活性成分羌活醇和异欧前胡素在须根中的含有量要明显高于其他部位，但传统上须根往往被认为药用价值低或没有药用价值而被直接去除，因而没能够有进入市场。因此，从本研究的结果来看，须根中活性成分含有量高，应当也具有较高的药用价值，应予以充分利用。

3 讨论

3.1 提取方法的选择本实验比较了甲醇、乙醇、水3种提取溶剂对提取效果的影响。结果表明:用水作提取溶剂对羌活醇、异欧前胡素等极性较小化合物的提取效果不佳，色谱峰主要集中在保留时间较小的一段，且峰面积明显小于甲醇和乙醇所提样品。乙醇和甲醇提取时，色谱图基本一致，但甲醇提取时总色谱峰面积大于用乙醇提取，而且甲醇有利于直接进行HPLC分析，故选择纯甲醇作为提取溶剂。

考虑到回流提取需要加热，时间也较长，提取过程中化合物容易发生电离、氧化、水解等化学反应，使得部分化学成分随着提取过程而损失。此外，回流提取需要的有机溶剂也较多。因此，本实验选择超声提取作为提取方法。根据《中国药典》所描述的方法及相关文献［12-13］，最终选择如下提取条件:取羌活样品0.4 g，加甲醇50 mL超声提取 (功率250 W，频率50 kHz)30 min。

3.2 色谱条件的优化在建立分析方法前，对分析香豆素常用的流动相体系进行了考察，比较了乙腈-水、甲醇-水、乙腈-不同质量分数冰醋酸水溶液(0.1%、0.2%、0.3%)、甲醇-不同质量分数冰醋酸水溶液 (0.1%、0.2%、0.3%)4种体系的分离效果，通过综合比较，最终选择甲醇-0.3%的冰醋酸水溶液作为流动相体系，并在此基础上进一步考察了该体系下不同柱温 (25、30、35℃)、不同体积流量 (0.6、0.8、1.0 mL/min)对分离效果的影响，柱温30℃，体积流量0.6 mL/min时分离效果佳。通过对照品在200～400 nm范围内的DAD全波长扫描结果可知，绿原酸、阿魏酸、紫花前胡苷、补骨脂素、佛手柑内酯、欧前胡素、羌活醇、异欧前胡素的最大吸收波长分别为326、323、336、295、312、302、312、310 nm，本实验选择336 nm(紫花前胡苷)，325 nm(绿原酸和阿魏酸)，310 nm(佛手柑内酯、羌活醇、异欧前胡素、欧前胡素)，295 nm(补骨脂素)作为检测波长，采用多波长法同时测定各成分。

3.3 多成分测定不同商品等级的羌活中主要有机酸和香豆素的含有量存在差异，绿原酸、阿魏酸的含有量与传统评价方法基本一致;但紫花前胡苷、佛手柑内酯、羌活醇和异欧前胡素的含有量与传统的以外观形态论品质的判断标准有一定的差异，在根 (条羌、须根)中的含有量反而高于根茎 (蚕羌、竹节羌、大头羌)中的含有量。特别是羌活中2种主要的活性成分羌活醇和异欧前胡素在须根中的含有量要显著高于其他部位。

本实验按照文献和药典所规定的等级划分方法将采自同一产地的野生羌活分成5个部分，选择羌活中几种常见且容易购买到的对照品作为定量指标，从有机酸和香豆素含有量的角度来评价不同等级间的内在品质，实验所用样品采自同一产地，避免了市售样品不同产地间的差异所带来的影响。本实验结果对于正确认识羌活药材的内在质量提供了实验依据，为从化学信息的角度修订羌活药材的商品规格标准提供了参考。

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