银翘解毒丸特征图谱初步研究

2012-07-26熊慧林

中成药 2012年11期

罗曼，周兰，申璀，熊慧林

(贵州省食品药品检验所，贵州贵阳550004)

银翘解毒丸由金银花、连翘、薄荷、荆芥、淡豆豉、牛蒡子 (炒)、桔梗、淡竹叶、甘草九味中药组成，具有疏风解表，清热解毒的功能。现行法定标准有:《中国药典》2005年版一部、《中国药典》2010年版一部、《卫生部标准》中药成方制剂第十四册、《卫生部标准》中药成方制剂第十九册、国家药品监管局标准 (试行)WS-564(Z-110)-2002、国家药品监管局标准 (试行)YBZ27002005。各标准收载的检测指标有显微特征鉴别、薄层色谱定性鉴别及高效液相色谱定量测定等。现行标准收载的每种检测指标针对性强，但覆盖面有限，仅针对性地对方中1～2种药味进行检测，由于银翘解毒丸处方药味较多，难以反映检测样品的全貌，有必要建立有效手段全面评价样品质量。中药指纹图谱及特征图谱的研究应用为更全面控制中成药质量提供了良好的研究前景，目前已有部分文献报道采用指纹图谱及特征图谱探索成药质量控制研究［1-5］，但大部分指纹图谱及特征图谱的研究仍集中于单味药材的质量控制。银翘解毒丸的研究报道主要为银翘解毒丸定量测定研究［6-7］及处方中单味原料药材的指纹图谱及特征图谱研究［8-11］，尚无银翘解毒丸制剂特征图谱的研究报道。根据本品法定标准收载的处方与制法模拟制备银翘解毒丸10批，采用HPLC方法探索建立银翘解毒模拟丸的特征图谱，研究特征图谱中特征峰的归属，为有效评价银翘解毒丸的质量提供了一定的研究基础。

1 仪器和试药

Aglient 1260液相色谱仪，Aglient 1260 DAD VL检测器，HP液相色谱工作站。甲醇为色谱纯(Tedia company)，水为重蒸馏水，其余试剂均为分析纯。参照物绿原酸 (中国药品生物制品检定所:110753-200413)、连翘苷 (中国药品生物制品检定所:110821-200609)、牛蒡苷 (中国药品生物制品检定所:110819-200505)。

处方中九味药材各10批分别来源于广西、江西、江苏、贵州、浙江、内蒙、湖南、陕西、河北、四川、甘肃、陕西、河南、吉林、山东、山西、新疆等地，经本所中药室熊慧林及贵阳中医学院陈德媛教授鉴定均符合2010年版《中国药典》一部［12］要求。按银翘解毒丸质量标准收载的处方与制法制备模拟丸剂10批，编号分别为WJ1～WJ10。

市售商品银翘解毒丸5批，为四川省宜宾五粮液集团宜宾制药有限责任公司产品2批 (批号1008021，采样地点四川;批号1008011，采样地点四川)，北京同仁堂科技发展股份有限公司产品3批(批号0035965，采样地点山西;批号0035967，采样地点辽宁;批号1036303采样地点河北)。

2 实验方法

2.1 色谱条件 Kromasil 100-5 C18色谱柱 (4.6 mm ×250 mm);检测波长279 nm，柱温30℃;甲醇为流动相A，0.2%磷酸为流动相B，进行线性梯度洗脱，0～10 min，A由10%线性改变至20%，10～30 min，A线性改变至30%，30～50 min，A线性改变至37%，50～80 min，A线性改变至50%;检测波长279 nm;体积流量1 mL/min;进样量10 μL。理论板数按绿原酸计不低于5000。

2.2 对照品溶液的制备精密称取绿原酸对照品0.01973 g，置100 mL量瓶，加甲醇溶解稀释至刻度;连翘苷对照品0.01362 g，置50 mL量瓶，加甲醇溶解稀释至刻度;牛蒡苷对照品0.01058 g，置50 mL量瓶，加甲醇溶解稀释至刻度;分别量取上述绿原酸对照品溶液2 mL，连翘苷对照品溶液1 mL，牛蒡苷对照品溶液5 mL，置同一10 mL量瓶，加甲醇溶解稀释至刻度，摇匀，即得混合对照品溶液 (每1 mL各含绿原酸、连翘苷、牛蒡苷分别为 39.46 μg、27.24 μg 、105.8 μg)。对照品色谱图见图1。

图1 混合对照品色谱图Fig.1 HPLC chromatogram of the reference substances

2.3 供试品液制备取模拟丸剂，研细，取约4.5 g，精密称定，置具塞锥瓶中，精密加入甲醇25 mL，超声处理 (功率250 W，频率40 kHz)30 min，放冷，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。样品色谱图见图2。

图2 银翘解毒丸对照特征图谱Fig.2 Standard chromatogram of simulated Yinqiao Jiedu Pills

2.4 精密度试验分别精密吸取同一供试品 (重复性1)溶液各10 μL，连续重复进样6次，按2.1项下条件检测，采用中药色谱指纹图谱的相似性计算软件对6次测定结果进行计算，其相似度均为0.99以上，以绿原酸峰为对照峰，各共有峰的相对保留时间RSD值为0～0.07%，其相对峰面积的RSD值为0～0.98%，结果表明仪器等整个检测系统的精密度良好，符合指纹图谱的要求。

2.5 重复性试验取同一批次的供试品 (模拟丸一)共6份，精密称定，按2.3项下制备，按2.1项色谱条件检测，6次测定的图谱其相似度均为0.99以上，以绿原酸为对照，各共有峰的相对保留时间RSD值为0～0.08%，其相对峰面积的RSD值为0～2.98%，结果表明同一批次的6份供试品色谱特征图谱相似，没有明显的差异，方法的重复性良好，符合特征图谱的要求。

2.6 稳定性实验取2.5项下同一供试品溶液，分别在0、4、8、12、16、24 h进行检测，获得不同时间进样的供试品色谱其相似度均为0.99以上，各共有峰的相对保留时间RSD值为0～0.06%，相对峰面积的RSD值为0～3.15%。结果表明，在24 h内银翘解毒模拟丸的特征图谱基本稳定，没有明显的变化，符合特征图谱的要求。

2.7 银翘解毒丸样品标准特征图谱的建立比较10批模拟丸供试品溶液谱图的相关参数，结合重复性试验、稳定性试验考查结果，删除10批样品色谱中平均相对峰面积小于0.03的色谱峰、重复性试验及稳定性试验中相对保留时间及相对峰面积RSD大于5%的色谱峰以及峰形不佳的色谱峰，发现色谱图中14个峰 (包含S峰在内)为各批供试品共有，且符合特征图谱方法考查的要求，因此确定这14个峰为其共有峰。绿原酸峰最大，选作为S峰，11号峰为连翘苷，13号峰为牛蒡苷 (见图3)。10批模拟银翘解毒丸样品特征图谱共有峰的相对保留时间较一致，RSD为0～0.10%。10批模拟银翘解毒丸样品特征图谱共有峰的相对峰面积差异较大，RSD为0～99.44%。银翘解毒丸样品标准特征图谱应以相对保留时间为指标建立，根据上述数据建立相应的银翘解毒丸的特征图谱。10批银翘解毒丸特征图谱与标准特征图谱相似度在0.9以上 (见表1)。

2.8 银翘解毒丸样品特征图谱特征峰归属按照银翘解毒丸质量标准收载的制法，制备分别缺失金银花、连翘、薄荷、荆芥、淡豆豉、牛蒡子(炒)、桔梗、淡竹叶、甘草等九味药材的模拟阴性样品。取上述9种阴性样品，精密称定，按2.3项下制备，按2.1项下条件检测，将生成的阴性样品图谱与银翘解毒丸样品标准特征图谱进行比较，确定特征峰的归属。经图谱比较，甘草、金银花、连翘、牛蒡子4味药材有明显归属的色谱峰，分别为由5号，6号峰及其周围1～3个小峰形成的组峰 (甘草)、S峰 (金银花)、11号峰 (牛蒡子)、13号峰 (连翘)。如图4，图中GC-YX为缺甘草阴性样品;GC为甘草;TYH-YX为缺金银花阴性;LYS为绿原酸;NBZ-YX为缺牛蒡子阴性;NBG为牛蒡苷;LQ-YX为缺连翘阴性;LQG为连翘苷;YQJDW为银翘解毒丸。

图3 10批模拟银翘解毒丸样品特征图谱Fig.3 Common chromatograms of ten batches of simulated Yinqiao Jiedu Pills

表1 银翘解毒模拟丸样品的标准特征图谱相似度Tab.1 Similarity of simulated Yinqiao Jiedu Pills

2.9 样品检测评价根据银翘解毒模拟丸特征图谱特征峰的归属，评价银翘解毒丸。考虑到原料药材产地、采收时间、贮存条件以及生产工艺参数的差异，兼顾特征图谱适用性，仅评价抽验样品色谱图中是否检出2.8项中所述特征峰:5、6号峰及其周围的1～2个小峰形成的组峰中的任一色谱峰(甘草)、S峰 (金银花)、11号峰 (牛蒡子)、13号峰 (连翘)。经考查特征图谱重复性、稳定性的相对保留时间和10批模拟丸剂的相对保留时间离散度很小，RSD均小于2%，故规定特征峰相对保留时间限度为±2%。根据10批次模拟丸特征图谱特征峰的相对峰面积分布，综合考虑样品生产中多重因素的影响，确定除S峰外的特征峰的丰度最低不小于10批次模拟丸剂中相对峰面积均值的50%。

限度范围为:应检出S峰 (金银花)，5号峰(甘草组峰)～6号 (甘草组峰)的相对保留时间区间内［1.827× (1±0.02)～1.861× (1±0.02)］至少一个相对峰面积不低于0.02的色谱峰，11号峰 (牛蒡子)相对保留时间为2.942×(1±0.02)且相对峰面积不低于0.2的色谱峰，13号峰 (连翘)为相对保留时间3.242×(1±0.02)且相对峰面积不低于0.04的色谱峰。

图4 银翘解毒丸特征图谱特征峰定位Fig.4 Locating common chromatograms of Yinqiao Jiedu Pills

按本实验特征图谱检测法，测定市售银翘解毒丸5批，均检出金银花、甘草、牛蒡子、连翘的特征峰，如图5。

图5 市售银翘解毒丸特征图谱Fig.5 Common chromatograms of Yinqiao Jiedu Pills in market

3 讨论

3.1 本实验选择对共有特征峰中最大的色谱峰绿原酸峰作指标考查样品的提取时间，以甲醇超声处理30 min的测定值最高，增加提取时间，测定值不再增加，从而确定样品提取方法为甲醇超声处理30 min。

3.2 本实验探索考查了特征图谱的色谱系统及检测波长。研究中尝试了乙腈-0.2%磷酸系统的梯度洗脱，发现色谱峰保留时间不够稳定，色谱图变化较大。甲醇-0.2%磷酸系统较稳定，但不同梯度洗脱结果存在较大差异，经反复试验确定本实验所述的流动相梯度分离效果及色谱峰形最佳。检测波长比较了230、240、260、270、279、320 nm，发现279 nm波长处检测特征色谱峰较多，各特征色谱峰相对保留时间稳定，杂质干扰较少，故确定279 nm为检测波长。

3.3 中药特征图谱技术是目前公认的鉴别中药品种和评价中药质量的有效手段，其优点在于可全面反映中药复杂的化学成分及其相对比例，在有效成分尚未完全阐明的情况下，可有效地表征中药质量。中药色谱特征图谱是一种综合的，可量化的鉴别手段，是符合中药特色的质量控制模式之一［13］。本实验建立了银翘解毒丸剂特征图谱检测方法，由于本品组方较为复杂由九味药材组成，10批模拟丸中的九味药材皆来源不同 (产地或批次不同)，10批银翘解毒丸剂特征图谱共有14个共有特征峰，绿原酸峰最大，选作为S峰，牛蒡苷、连翘苷分别为样品的11号、13号共有特征峰。从结果分析，多数的商品药材化学成分相对稳定，质量较高，相似度均大于0.9。由于药材为天然产物，样品的理化成分为其在自然界产生的代谢物质，其量的高低受产地、气候、采收季节等因素的影响而不同，对于成药而言影响因素还有生产过程中工艺参数的控制、运输及储存等的影响。样品中的理化成分种类的数量则相对稳定，仅每种物质的含有量或相对丰度存在差异。基于上述考虑，本实验考察了10批次的模拟丸，运用《中药色谱特征图谱相似度评价系统2004A版》软件分析，评价模拟丸剂图谱与10批模拟丸剂生成的标准特征图谱的相似性，其相似度在0.85以上。10批样品中相对保留时间的离散度很小，14个共有特征峰的相对保留时间的RSD均在0.11%以下。10批样品中相对峰面积的离散度较大，14个共有特征峰的相对峰面积的RSD最高可达99.44%。实验结果表明样品中的理化成分种类相对稳定，而理化成分的量受多因素的影响存在较大的变化。

3.4 考虑到银翘解毒丸批准文号较多，全国大部分地区均有生产企业，不同地域生产企业投料用原料药材可能存在较大差异如产地及批次等，很难确定一个极具代表性的产品。基于上述原因，本实验从全国各地收集经鉴定符合2010年版《中国药典》一部要求的九味原料药材各10批，按法定标准的处方及制法自制银翘解毒丸作为特征图谱的探索性研究的试验对象。本实验中模拟丸为试验室小试样品与企业大规模生产存在差异，两者特征性的差异有待进一步研究。但作为多指标定性质量控制方法的建立，本实验研究具有一定的研究意义，实验建立的特征图谱，专属性强，重复性好，可有效地鉴别和评价银翘解毒丸的质量优劣，为全面评价银翘解毒丸的质量提供了一定的研究基础。

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