针药并用对绝经后骨质疏松症大鼠血清E2、骨密度的影响

潘芳芳,周志华,王永平,王兴辕,赵丽霞,陈华德

(1.杭州市余杭区第一人民医院针灸科,浙江 311100;2.浙江中医药大学,杭州 310053)

绝经后骨质疏松症(postmenopausal osteoporosis,PMOP)又称Ⅰ型骨质疏松症,指由绝经引起的骨量减少或(和)骨组织微结构破坏,导致骨强度下降、骨脆性增加,极易发生骨折。临床表现主要是腰背疼痛,身长变短,甚者骨折,以及因此而引起的多种并发症。PMOP是中老年妇女的常见病、多发病,女性在50岁后可见明显的骨质丢失加速,40岁以上骨质疏松症总患病率女性为 15.7%,50～79岁人群骨质疏松症患病率女性为67.3%。并有较高的致残率和致死率,是公认的七大疾病之一。因此,绝经后骨质疏松症的治疗成为现在人类关注的焦点。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器

骨化三醇(罗盖全)胶丸(0.25 mg/粒,10粒装,上海罗氏制药有限公司);S-E2试剂盒(USCNLIFE,中美合资武汉中美科技有限公司提供);动态过滤双能X线骨密度仪(美国Norland公司,NorlandXP-36);低速离心机(科大创新股份有限公司中佳分公司,KDC-1044);酶标比色仪(上海科华实验系统有限公司,KHB ST-360);一次性无菌针灸针(由佳辰针灸器械有限公司提供,规格 0.25 mm×25 mm);韩式电针仪(北京华卫产业开发公司,型号LH202H)。

1.2 动物

清洁级SD雌性大鼠70只,体重(200±15)g,由上海实验动物中心提供,饲养于浙江中医药大学实验动物中心。

1.3 方法

1.3.1 模型制作

造模方法参照文献[1,2],雌性大鼠去势,模拟妇女绝经后的骨质疏松模型。去势手术用 10%水合氯醛3 mL/kg腹腔注射麻醉满意后,仰卧固定于手术板上,严格无菌操作,络合碘消毒,并沿下腹部正中线切开皮肤,钝性分离(筋膜、肌肉、腹膜)逐层进入腹腔,可见乳白色组织,轻轻将之提出腹腔,即可见被包裹的粉红色黄豆大小“桑椹样”卵巢,分离后钳夹、结扎,剪去双侧卵巢,检查有无渗血,将脂肪组织送回腹腔内,分两层间断缝合关闭腹腔和缝合皮肤,络合碘切口消毒,外涂青霉素粉。保温待麻醉苏醒。假手术,麻醉及手术步骤均同上,入腹腔后,仅切除双侧卵巢附近一小块脂肪,即止血逐层缝合。保温待麻醉苏醒。

1.3.2 动物分组及处理

将70只SD雌性大鼠随机分为造模组53只,假手术组17只。按上述方法进行造模,术后90 d,造模组、假手术组各任取 5只检测相应指标观测造模是否成功。将48只造模组大鼠随机分为模型组、电针组、药物组、针药组,各12只;假手术组剩余11只。假手术组、模型组不行任何治疗;电针组根据华兴邦提供的大鼠腧穴定位和针刺方法,将所选腧穴分为两组,第一组为肾俞(双)、命门、悬钟(双),第二组为关元、子宫(双)、足三里(双)、三阴交(双),两组腧穴交替进行针刺,每组选两个腧穴接韩式电针仪,第一组选肾俞、悬钟,第二组选子宫、足三里,每次接同侧两个腧穴,双侧腧穴交替进行刺激,选用疏密波,2/100 Hz,强度1 mA,以肢体抖动为度,每次15 min,每日1次,24次为1个疗程,疗程间休息 6 d,共治疗 90 d;药物组用骨化三醇 0.025 mg/只灌胃,每日 1次,共治疗 90 d;针药组采用电针与药物治疗相结合,治疗方法及疗程同上。

1.3.3 标本采集

末次给药后所有大鼠禁食。24 h后,予腹腔注射麻醉后腹腔静脉取血,在消毒试管中室温(18～25℃)静置 2 h后,离心 15 min(4000 r/min),取上清液于－20℃低温冰箱保存待测;各组大鼠采血处死后,完整摘取右股骨、腰椎 L1-L4,剥离骨周围软组织,保护骨膜、骨附件等,用生理盐水纱布包裹,于－20℃低温冰箱保存,用于测骨密度。

1.3.4 观察指标检测

S-E2指标采用酶联免疫吸附测定法(ELISA)测定;骨密度(BMD)检测用双能 X线骨密度诊断仪在小动物测量软件高分辨率模式下对大鼠腰椎和右侧股骨进行扫描测定。

1.4 统计学方法

应用SPSS11.5统计软件,数据均以“平均数±标准差”表示,多组计量资料用单因素方差分析(oneway-ANOVA),组间比较用LSD检验,两组计量资料用独立样本t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组动物样本脱落情况

假手术组、电针组、药物组、针药组分别死亡大鼠1只。死亡大鼠数据统计不全,弃用。

2.2 模型判定

术后90 d,造模组、假手术组各随机抽取5只大鼠,检测相应指标,判断造模是否成功。详见表1。

表1 造模后去势大鼠 S-E2、右侧股骨及 L1-L4骨密度的变化比较 (±s)

表1 造模后去势大鼠 S-E2、右侧股骨及 L1-L4骨密度的变化比较 (±s)

注:与假手术组比较1)P＜0.05,2)P＜0.01

组别 n S-E2(Pg/mL) 右侧股骨(g/cm2) L1-L4(g/cm2)假手术组 5 12.69±0.47 0.162±0.021 0.147±0.005造模组 5 11.24±0.082) 0.134±0.0051) 0.102±0.0202)

与假手术组比较,造模组S-E2降低,差异有统计学意义(P＜0.01);造模组右侧股骨骨密度明显降低(P＜0.05),L1-L4骨密度明显降低(P＜0.01),根据以上结果判定造模成功。

2.3 治疗后各观察指标比较

2.3.1 治疗后各组大鼠S-E2水平的比较

与模型组比较,各治疗组均能提高去势后大鼠S-E2水平(P＜0.01),电针组较药物组明显(P＜0.05),针药组较电针组明显(P＜0.05)。详见表2。

表2 不同疗法对去势大鼠S-E2水平的影响比较 (±s)

表2 不同疗法对去势大鼠S-E2水平的影响比较 (±s)

注:与假手术组比较1)P＜0.05,2)P＜0.01;与模型组比较3)P＜0.01;与电针组比较4)P＜0.05;与药物组比较5)P＜0.01

组别 n S-E2(Pg/mL)假手术组 11 12.79±0.97模型组 12 11.21±0.252)电针组 11 11.84±0.442)3)药物组 11 11.69±0.322)3)4)针药组 11 12.32±0.471)3)4)5)

2.3.2 治疗后各组大鼠骨密度比较

与模型组比较,各治疗组均能提高右侧股骨和 L1-L4骨密度(P＜0.05),电针组较药物组在 L1-L4骨密度改善上效果明显(P＜0.05),针药组较药物组(P＜0.05)、电针组(P＜0.05)在右侧股骨和L1-L4骨密度提高上均明显。详见表3。

表3 不同疗法对去势大鼠右侧股骨及 L1-L4骨密度的影响比较 (±s)

表3 不同疗法对去势大鼠右侧股骨及 L1-L4骨密度的影响比较 (±s)

注:与假手术组比较 1)P＜0.05,2)P＜0.01;与模型组比较 3)P＜0.05,4)P＜0.01;与电针组比较5)P＜0.05;与药物组比较6)P＜0.05,7)P＜0.01

组别 n 右侧股骨(g/cm2) L1-L4(g/cm2)假手术组 11 0.166±0.022 0.145±0.027模型组 12 0.110±0.0232) 0.078±0.0142)电针组 11 0.129±0.0202)3) 0.113±0.0202)4)药物组 11 0.126±0.0142)3) 0.093±0.0142)3)5)针药组 11 0.146±0.0191)4)5)6) 0.129±0.0144)5)7)

3 讨论

绝经后骨质疏松的发生普遍认为是卵巢功能衰退引起雌激素(E2)的分泌降低,雌激素缺乏导致妇女内分泌的紊乱为主要因素。E2降低,骨对PTH的敏感性增加,破骨细胞活性增强,抑制成骨细胞,同时使CT通过破骨细胞的降钙素受体抑制破骨细胞的骨吸收活动减弱,骨吸收增加,骨量流失加速。

绝经后骨质疏松症可归为中医学“骨痿”、“骨痹”范畴。《素问·逆调论》:“肾不生则髓不能满……所以不能冻傈者……名曰骨痹。”《素问·痿论》:“肾气热,则腰背不举,骨枯而髓减,发为骨痿。”

肾为先天之本,性命之根,主骨生髓藏精,固真阴而寓元阳。《素问·宣明五气篇》明确指出:“肾主骨。”《素问·六节脏象论》:“肾者,主蛰,封藏之本,精之处也;其华在发,其充在骨。”现代中医学对于中医肾的研究表明,肾虚者多具有下丘脑-垂体-性腺轴功能减退,性腺激素分泌减少,使成骨功能下降,单位体积内骨组织减少,最终导致骨质疏松[3]。故肾中精气不足失于养骨是骨质疏松发病的关键。

脾为后天之本,为人体气血生化之源,先天之精赖后天水谷精微的不断充养。《灵枢·本身》:“脾气虚则四肢不用。”李东垣认为脾虚肾亏是骨痿发生的根本,他在《脾胃论·脾胃胜衰论》中指出:“形体劳疫则脾病……脾病则下流乘肾……则骨乏无力,是以骨痿。”现代医学认为,脾虚证产生的机制是胃肠道的一种虚损性功能低下或失调[4]。脾胃通过大脑-下丘脑-垂体的途径而后才影响到肾上腺皮质及性腺的功能[5]。钙、磷等微量营养物质在骨质疏松症的发病中有重要作用,当脾虚时,运化功能减弱,影响其吸收而发生骨质疏松。

本实验选用肾俞、命门、悬钟调补先天,关元、足三里、三阴交调补后天,可以广泛影响消化系统、内分泌系统、免疫系统,对人体产生整体调节作用。肾俞具有补肾益精壮骨作用;命门,又名“精宫”,陈士铎在《石室秘录》中说:“肾得命门而作强”,具有很强的培元补肾的作用。悬钟穴,又名“绝骨”、“髓会”,可祛风湿,利筋骨,养髓补血。研究表明艾灸悬钟穴可以提高摘除双侧卵巢的模型大鼠的成骨细胞活性,使骨生成加快,病理组织检查也证实这一点,提示有防止骨小梁萎缩的作用[3]。关元、三阴交、足三里三穴合用,具有补益冲任、调理肝脾肾、益气养血之功[6],研究表明,电针足三里、关元可升高围绝经期模型大鼠血清E2和下丘脑b-EP的含量,说明电针能良性调整围绝经期模型大鼠体内的神经内分泌改变[7]。此外,骨密度测量部位选择主要是根据目前临床上双能X线测定方法最常用部位确定的,腰椎(L1-L4或 L2-L4)和股骨近段测量是主要的研究和测量骨量、骨密度的骨骼区域,测量的敏感性和准确性较高。

骨化三醇是维生素D3的最重要活性代谢产物之一,通过对骨骼中成骨细胞活性的刺激作用而调节钙平衡,治疗骨质疏松症。口服本品可使肠道吸收钙的能力恢复正常,纠正低血钙、过高的血碱性磷酸酶和血甲状旁腺素浓度,能减轻骨与肌肉疼痛,并矫正发生在纤维性骨炎和其他矿化不足病人中的组织学改变。

实验结果显示,模型组及各治疗组大鼠较假手术组S-E2明显降低(P＜0.05),模型组、电针组、药物组右侧股骨和 L1-L4骨密度均明显降低(P＜0.01),针药组右侧股骨密度明显降低(P＜0.05),腰椎骨密度有降低,但无显著性差异(P＜0.05),充分说明去势后大鼠骨吸收增加,骨量丢失明显;同时三种疗法均能不同程度地提高S-E2含量(P＜0.01),增加骨密度(P＜0.05),电针组在结果上显示优于药物组(P＜0.05),但针药组大鼠 S-E2含量、骨密度的变化比较明显,更加接近假手术组,与药物组、电针组比较有显著差别(P＜0.05),从而显示出该治疗方法的优越性。电针组和针药组治疗效果明显,其理论可能与现有研究针刺调理脾肾为主能调节其下丘脑-垂体-性腺/肾上腺的功能低下,提高S-E2水平,改善患者衰老症状,改善机体生理功能相一致[8,9]。

综上所述,通过以上穴位的相互配伍,达到补肾健脾、益精填髓壮骨的作用,通过电针、药物并用达到恢复下丘脑-垂体-卵巢轴/肾上腺轴,纠正机体激素失衡和负钙平衡的能力,抑制骨吸收,促进骨形成,从而达到治疗骨质疏松的作用。

[1]王东岩,沙正达.针刺结合口服阿仑膦酸钠对绝经后骨质疏松症前臂骨密度的影响[J].江苏中医药,2008,40(12):76-77.

[2]Mechael Bolognese. Effective Pharmacotherapeutic Interventions for the Prevention of Hip Fractures[J]. The Endocrinologist, 2002,12:29-37.

[3]吴明霞,吴炳煌,刘献祥,等.艾灸对绝经后骨质疏松症影响的实验和临床研究[J].中国针灸,2002,22(5):334-336.

[4]危北海,金敬善,赵子厚,等.“脾虚综合征”一种新的病证诊断学概念[J].中国中医基础医学杂志,1997,3(1):6-9.

[5]徐复霖,田维君,吴仁九.脾胃理论与临床[M].长沙:湖南科学技术出版社,1990:340.

[6]Zhou Zhihua, Wang Naiquan, Pan Fangfang,et al. Clinical Observation on Combined Acupuncture and Medication for Osteoporosis in Postmenopausal Women[J]. J Acupunct Tuina Sci, 2001,9(6):370-375.

[7]胡玲,汪慧丽,高忻洙,等.电针“关元”与“三阴交”对围绝经期模型大鼠性激素及下丘脑b-EP调整作用的比较[J].中国针灸,2004,24(9):649-651.

[8]刘炎,王维健.针刺补肾健脾法治疗骨质疏松症的临床观察[J].针灸临床杂志,1996,12(7):24-25.

[9]杨廉,刘媛媛,路暾,等.温针灸“肾俞”穴对老年雌性大鼠性激素的影响[J].中国针灸,2001,21(3):172-173.