改变大脑5-羟色胺水平对戊四氮点燃大鼠癫形成过程的影响

陈文珍，王开颜，洪 震，刘学源，陈玉娟

(1.同济大学附属第十人民医院神经内科，上海 200072;2.复旦大学附属华山医院神经内科，上海 200040)

研究近年表明，戊四氮(pentylenetetrazol，PTZ)诱发急性癫发作和慢性癫模型形成过程5－羟色胺(5－HT)动态变化中，在急性发作海马5－HT显著升高，在慢性癫模型形成过程，海马5－HT水平随着点燃的时间延长而逐步降低［1－2］。那么脑内5－HT水平升高或降低对癫的形成会有什么样的影响呢?本文分别用西酞普兰(升高5－HT)和利血平(降低5－HT)干预，研究大脑5－HT变化对PTZ点燃慢性癫形成过程的影响，为癫形成的干预措施提供有效的证据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

PTZ、5－HT(Sigma USA);水合氯醛(上海化学试剂公司);多导生理记录仪(BioPAC systems MP150，USA)。

脑内微透析系统:包括CMA/120清醒动物装置、CMA/102微量泵、CMA/170低温样品收集器、CMA/150动物温度控制器、CMA/12微透析探头(膜长2 mm、内径400 mm、外径500 mm、允许透过的最大分子质量界限值为20 000道尔顿)，套管，微电脑工作站，2 μm无菌针头滤膜。

高效液相色谱仪组成:ESA Model 582 pump，BAS Sample Sentinel autosampler，and ESA CouloChem Ⅲ detector，Enhanced Model 5041 Cell，Model 5020 Guard Cell，EZChrom Elite data system.BAS USA。

1.2 实验大鼠分组和模型大鼠癫发作程度的评估

清洁级健康成年雄性Wistar大鼠48只，体质量250～300 g(复旦大学上海医学院实验动物部提供)。置室温(24±2)℃，24 h昼夜循环光照条件下生活，保证环境安静和昼夜节律。大鼠随机分为4组:(1)对照组，每日同一时间点，腹腔注射生理盐水;(2)戊四氮组(PTZ group，PTZ组)、每日同样时间腹腔注射1%PTZ(Sigma公司，美国)35 mg/kg，且在用PTZ注射前0.5 h予以生理盐水1 ml/d灌胃7 d作为对照，分别在 PTZ注射第7、14、21、28 d的发作间期(PTZ注射诱发癫发作后3 h)行微透析取样。(3)西酞普兰组(CTP+PTZ group，CTP组):为了评估5－HT水平升高对癫形成的影响作用，用西酞普兰(一种选择性5－HT再摄取抑制剂)提高大鼠脑内5－HT浓度，在用PTZ每日(35 mg/kg)腹腔注射一周前开始给予西酞普兰(Citalopram，西安杨森公司提供)灌胃，0.5 mg/kg(按成人剂量20 mg/d，折算而得)干预。每日在PTZ腹腔注射前0.5 h予西酞普兰灌胃，在PTZ腹腔注射第7、14、21、28 d的发作间期(PTZ注射诱发癫发作后3 h)进行微透析取样。(4)利血平组(RSP+PTZ group，RSP 组):为了评估 5－HT 水平降对癫形成产生的作用，用利血平(5－HT耗竭剂)降低5－HT水平，每日在PTZ(35 mg/kg)腹腔注射一周前开始给予灌胃利血平(Reserpine，复旦复华制药)，1 mg/kg(按成人剂量40 mg/d，折算而得)干预，每日在PTZ注射前0.5 h予利血平灌胃，在PTZ腹腔注射点燃第7、14、21、28 d发作间期(PTZ注射诱发癫发作后3 h)进行微透析取样。

1.3 微透析活体获取大鼠脑海马组织间液［4］

1.3.1 微透析探针外套管和海马电极导管安置术10%的水合氯醛300 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠至大鼠翻转反射消失，再以2%利多卡因双侧外耳道表面麻醉，将大鼠头颅水平固定于立体定向仪上(背朝上固定呈头颅水平位)。常规消毒，正中矢状位切口，分离骨膜，用3%H2O2止血并充分暴露前囟，确认前后囟在同一平面。根据Paxinos and Watson的《大鼠脑立体定位图谱》［5］确定右侧海马CA1和CA3区靶点:CA1区在前囟向后5.6 mm，矢状缝线向右侧4.6 mm，硬膜向下4.6 mm，置入微透析外套管;CA3区前囟向后2.64 mm，矢状缝线向右侧2.0 mm，硬膜向下 4.0 mm，置入电极导管。

同时在颅骨上旋入4 mm螺丝，与其他两点形成三角形，用牙科水泥固定在钻孔周围的颅骨上，待牙科水泥凝固后形成一个平面，常规消毒并缝合伤口，待大鼠清醒后送回动物房。实验中保证微透析实验和脑内海马电极检查顺利进行。

1.3.2 人工脑脊液配置［6］NaCl 126、KCl 5、MgSO42、CaCl22、NaH2PO41.25、NaHCO326、Glu 10 mmol/L，调节 pH 值为7.4，2 μm 无菌针头滤膜过滤，4℃冰箱保存，2周内用于微透析实验。

1.3.3 微透析活体取样 在大鼠清醒状态下移去导引管针芯，连接微透析装置，排出系统中的气泡，将探针沿导管插入大鼠海马，探针前端2 mm半透膜完全置于海马内，微量泵内充满人工脑脊液，微灌注泵以2 μl/min的恒定流速使人工脑脊液通过流入管、探针、流出管。平衡1 h，使探针内人工脑脊液和大鼠海马细胞外液的物质交换趋于稳定，然后连接微透析装置以便检测。

1.3.4 取样时间 在第7、14、21、28 d发作间期分别取样1次，每次收集 30 min透析液样品，置Eppendorf管中，每管 60 μl，－80 ℃ 冰箱保存，2 周内用于高效液相检测;对照组取样1次。

1.3.5 各组体外回收率测定法 配置333 ng/ml，5－HT标准液，37℃，将探针前端浸在溶液中，以2 μl/min的流速推动人工脑脊液通过探针。平衡1 h后，连续收集流出液60 μl/次，共3管。

1.3.6 高效液相检测仪 分别检测回收脑组织间液和标准液中 5－HT、5－HIAA 浓度。

1.3.7 5－HT、5－HIAA 浓度和 5－HT 转化率公式

1.3.8 海马靶点确认 实验结束后用4%多聚甲醛对动物进行心脏灌流，取鼠脑，冰冻切片机切片，行苏木精－伊红染色确定探针所在位置为海马。

1.4 脑电图(EEG)记录

1.5 统计学方法

应用SPSS14.0统计软件进行统计学处理，计量数据以±s表示，应用均数两两比较t检验。

2 结 果

2.1 行为学观察结果

生理盐水对照组未出现发作。(1)在点燃期间，CTP组，14 d以内，其发作程度为1～3级，发作潜伏期较长，20 d左右出现5级发作，24 d全部点燃，无动物死亡;在点燃期间，CTP组发作潜伏期延长，发作程度轻和点燃时间延长，发作死亡率低，与PTZ组比较差异有显著性(P＜0.05);点燃后，CTP组诱发发作潜伏期、发作程度等与戊四氮组比较无统计学意义。(2)在点燃期间，RSP组，在腹腔注射3～5 d内就出现3～5级发作，7 d就有3～4只点燃，10 d左右全部点燃，有2只出现癫持续状态后死亡;在点燃期间，RSP组诱发发作程度重，发作潜伏期短、点燃时间短，发作持续时间长，死亡率高，与戊四氮组和对照组比较差异有显著性(P＜0.05);点燃维持期，发作情况与戊四氮组差异无显著性，见表1。

表1 戊四氮点燃癫 形成过程各组主要参数比较Tab.1 Parameters of PTZ kindling epileptic model by different groups in rats

2.2 大鼠点燃后各组发作前后典型EEG表现(图1、2)

对照组为正常EEG。PTZ点燃第7、14、21天可见散在尖波，第28天可见自发癫样放电。PTZ点燃第7、14、21、28 天发作时出现癫波潜伏期随点燃时间延长而缩短，均出现尖波、棘波、尖慢及棘慢综合波等。在点燃期间(第7天和第14天)，各组脑电图典型表现略有差异，RSP组尖波爆发的幅度和数量均比CTP组高;在维持点燃期间(第21天和28天)，CTP组、RSP组和PTZ组的脑电图比较无明显差异。

图1 戊四氮点燃大鼠发作间期典型EEG表现Fig.1 Interictal typical EEG of PTZ kindling rats

图2 戊四氮点燃大鼠发作期典型EEG表现Fig.2 Ictal typical EEG of PTZ kindling rats

2.3 5－HT 和5－HIAA 浓度以及5－HT 转化率变化

体外回收率为15% ～20%，计算各组发作间期的5－HT和5－HIAA浓度以及5－HT转化率结果如表2所示。(1)在戊四氮点燃癫形成过程中，发作间期5－HT水平，点燃初期，CTP组大鼠的海马 5－HT 水平升高，5－HT 转化率(5－HIAA/5－HT)降低，与对照组和PTZ组比较有显著性差异(P＜0.05);维持点燃阶段，CTP组，5－HT 水平逐日降低，与戊四氮组比较无统计学意义;与对照组比较有显著性差异(P＜0.05);CTP组5－HIAA水平在点燃过程逐步降低与对照组和点燃不同时期比较，差异有显著性(P＜0.01)，与戊四氮组比较差异无统计学意义;点燃维持期5－HT转化率(5－HIAA/5－HT)变化与PTZ组和对照组比较无统计学意义。(2)RSP组，在点燃期间，5－HT水平降低与戊四氮组和对照组比较差异有显著性(P＜0.05);点燃维持期，RSP组5－HT水平逐渐下降与对照组比较有显著性差异(P＜0.05)和PTZ组比较无统计学意义;RSP组5－HIAA水平，呈逐日下降趋势，与对照组比较有显著性差异(P＜0.01)，与PTZ组比较无统计学意义;5－HT转化率(5－HIAA/5－HT)变化无统计学意义，与对照组和戊四氮组比较差异无显著性。

表2 4组各时间点PTZ点燃大鼠海马组织间液5-HT、5-HIAA浓度和5-HT转化率Tab.2 Concentration of 5-HT，5-HIAA and 5-HT turnover rate in hippocampus in different time of PTZ kindling rats(x±s)

3 讨 论

用西酞普兰和利血平分别提高和降低脑内5－HT水平，通过改变5－HT水平来研究PTZ点燃癫形成的变化。结果显示，戊四氮点燃癫形成过程中，在点燃早期，西酞普兰干预后使戊四氮诱发癫发作潜伏期延长，发作程度较轻，发作持续时间短，点燃时间延长，死亡率降低;但是，在点燃后，戊四氮诱发发作潜伏期，发作严重程度和发作持续时间与戊四氮组比较无明显的区别。脑电图显示在点燃早期西酞普兰延长了脑电图癫波出现的潜伏期，但是在点燃后，并没有减少脑电自发放电和抑制癫波爆发;用HPLC检测透析液结果证明，在点燃早期，CTP组海马 5－HT 显著升高，5－HT 转化率降低这与文献报道相一致［9］;点燃过程中，5－HIAA 水平呈持续性的降低，5－HIAA是5－HT的一种重要代谢产物，5－HIAA浓度在PTZ点燃过程中逐步减少，但是与5－HT变化并不一致，这跟Burger等研究发现细胞外5－HT水平升高并没有伴随着5－HIAA变化的结果相一致［10］。用 5－HIAA/5－HT 比值作为估计5－HT转化率和代谢的一种近似的工具［11］，在点燃早期(7d)与对照组比较5－HT转化率降低，提示西酞普兰作用下，可能导致5－HT分解代谢减少，有学者在PTZ惊厥模型中发现，在海马和前脑皮质有比较低的5－HT转化率，与结果相一致;他们也证明了，PTZ诱导癫发作减少了西酞普兰在海马的结合，这些数据提示，至少在PTZ模型，西酞普兰减少5－HT 再摄取，可能与 5－HT 转化率降低有关［7，12］。有文献报道，西酞普兰的作用依靠5－HT浓度和5－HT1A受体作用［12］，在点燃早期 5－HT 神经递质和受体活性没有受到明显破坏，给予西酞普兰干预，可以升高5－HT水平，降低5－HT转化率，储存足够的5－HT，而抑制癫发作，和延长点燃时间。到了点燃后，大鼠海马神经元坏死、丢失，也可能造成部分海马5－HT神经元丢失，分泌5－HT减少，所以，在点燃晚期，没有足够的5－HT浓度，西酞普兰不能够抑制癫发作，也不能阻断癫形成。

总之，西酞普兰戊干预四氮点燃期间可以提高脑内5－HT水平，延长点燃时间，减轻发作程度和降低死亡率，点燃形成后，西酞普兰无明显减轻发作作用;利血平降低5－HT水平，缩短点燃时间，加重发作程度，促进癫形成。升高5－HT水平对癫形成有一定的延缓作用。

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