大鼠腹膜间皮细胞的分离培养方法

马姝琛，严海东，庄守纲，兰 洋，张瑞青，王 奕

(同济大学附属东方医院肾内科，上海 200120)

随着终末期肾衰竭发病率的升高，临床上腹膜透析的运用越来越多。而随着透析龄的增加，腹膜透析的重要合并症腹膜失超滤的发生率也随之增加。已知腹膜间皮细胞在保持腹膜的正常结构和功能中起主要作用。为了探讨腹膜间皮细胞在腹膜失超滤中的作用，有必要建立一种简便有效的方法获取腹膜间皮细胞，本实验为在体外进行腹膜间皮细胞及腹膜的研究提供了有效手段。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 取材 雄性SD大鼠(体质量:120～160 g，由上海交通大学附属瑞金医院实验动物中心提供)无菌手术取得的大网膜及脾胃韧带。

1.1.2 主要仪器设备 超净台、吸管、离心管、0.22 μm滤膜过滤器、手术剪、眼科剪、镊子、培养皿、25 cm2培养瓶、普通离心机、CO2培养箱、倒置相差显微镜等。

1.1.3 主要试剂 磷酸盐缓冲液(PBS)、DMEM/F12培养液(加入青链霉素各100 μ/ml)、胎牛血清(FCS)、完全培养液(含15%FCS的DMEM/F12培养液)、细胞消化液(0.25% 胰蛋白酶 0.02%EDTA)、免疫荧光抗体(抗细胞角蛋白抗体)、免疫组化染色抗体(抗波形蛋白抗体、抗白细胞CD45抗体、抗第Ⅷ因子相关抗原抗体)

1.2 方法

1.2.1 RPMC的分离培养 无菌取得SD大鼠大网膜及脾胃韧带，置于培养皿内，PBS液洗3次。加入细胞消化液，置于37℃培养箱中消化约10 min。取出后加入等量完全培养液终止消化，吸管吹打约10 min。液体移入10 ml尖底离心管中，1000 r/min，离心5 min。弃上清。加入适量完全培养液重悬细胞，装于25 cm2培养瓶中。放置于37℃、5%CO2培养箱内培养。

1.2.2 RPMC的传代培养 消化下的RPMC置于37℃、5%CO2培养箱内培养，根据细胞贴壁情况24～48 h后予以首次换液。此后，每2～3 d换液一次。约5～8 d细胞生长融合，开始首次传代。PBS洗1次，加入细胞消化液约1 ml，镜下观察细胞消化情况，待细胞变圆脱落后，加入2 ml完全培养液终止消化，并适当吹打，液体移入10 ml尖底离心管内。1 000 r/min，离心5 min。弃上清，加入适量完全培养液重悬细胞。分装于25 cm2培养瓶中，继续置于培养箱内培养。

1.2.3 鉴定 取第2代RPMC置光镜下观察细胞形态，染色并计算纯度。鉴定:免疫荧光鉴定:细胞爬片经95%冷乙醇固定后，用抗细胞角蛋白荧光抗体染色;免疫组化鉴定:细胞爬片经95%冷乙醇固定后，分别用抗波形蛋白抗体、抗白细胞CD45抗体、抗第Ⅷ因子相关抗原抗体，行细胞免疫组化染色(图1～4)。

2 结 果

本实验结果显示从大网膜等消化而来的RPMC在光镜下呈葡萄串状。细胞培养约8 h即可开始贴壁生长，细胞呈多形性(梭形、椭圆形、多角形)，边缘不整，呈拉网状生长。以后细胞生长融合呈多角形，大小较一致，整体似铺路石外观。细胞免疫荧光染色提示细胞角蛋白抗原阳性，细胞免疫组化染色分析提示波形蛋白抗原阳性，白细胞CD45抗原、抗第Ⅷ因子相关抗原阴性。故可排除成纤维细胞、内皮细胞、白细胞，可证实本实验分离培养所得为腹膜间皮细胞。

3 讨 论

为提高RPMC分离培养的成功率需注意:①无菌操作非常重要。新鲜获取的组织最好及时处理。如不能马上处理，需浸泡于含青链霉素的PBS液中，尽量在24 h内使用。②严格掌握消化时间。时间过短会导致未能消化下所需细胞，时间过长会影响细胞的活性，细胞存活率明显下降，如消化时间超过30 min，则成纤维细胞的出现率将大于50%。③一般培养6～8 h即可开始贴壁，如仍未贴壁，则一般贴壁生长可能性明显降低，但一般初次换液仍将在培养24～48 h后进行，换液前尽量减少晃动以免影响其贴壁。④传代超过3次细胞可出现老化、形态异常。故实验最好采用前三代细胞。

目前PMC的分离培养方法较多，据文献介绍有直接将胰酶等注入腹腔消化获取消化液进行培养［1-2］，或从腹透流出液中分离、培养［3］，有将剪取的网膜组织直接接种于培养瓶中的直接消化法［4］，胶原酶消化法［5］等，因实验目的不同，各种方法都被采用，但都存在一定局限性，如细胞获取率较低，费时、费力，对仪器有特殊要求，培养周期长，费用昂贵等，而且人腹膜的获取还存在伦理问题。

本实验采用的是大鼠的网膜，采用胰酶消化法，用时短，重复性好，费用相对低廉，总之，可操作性强。为体外研究PMC的生理功能及其在腹膜炎、腹膜纤维化等防治中的作用提供了必要的、很好的物质基础。

［1］樊敏，刘伏友，段绍斌，等.改良法培养鼠腹膜间皮细胞［J］.湖南医科大学学报，2002，27(6):542－544.

［2］徐家云，樊小军，常洁，等.几丁糖对高糖腹透液刺激大鼠腹膜间皮细胞TGF-β1表达的影响［J］.第三军医大学学报，2010，32(13):1446 －1448.

［3］周循，凌光辉，邹莎琳，等.腹膜透析流出液中人腹膜间皮细胞的培养及转分化特征［J］.中国现代医学杂志，2010，20(17):2634 －2642.

［4］石永兵，金东华，詹周兵，等.人腹膜间皮细胞的原代培养及传代［J］.苏州大学学报:医学版，2010，30(2):307－309.

［5］董柯，陈香美，傅博，等.高糖和抗生素对大鼠腹膜间皮细胞表达 PAI和 TGF-β mRNA的影响［J］.中华内科杂志，1997，10(36):689 －692.