银杏叶提取物对环孢素A诱导的肾组织细胞凋亡及p27表达的影响

江 薇，李雪竹，严海东

(同济大学附属东方医院肾内科，上海 20120)

环孢菌素A(Cyclosporin A，CsA)是一种由亲脂性不完全真菌Tolypocladium inflatum Gams在生长过程中产生的多肽混合物，是自然界25种环孢素中免疫抑制活性最强的一种。CsA应用于器官移植后的抗排斥反应，使器官移植的预后得到了极大改观［1-2］。近年来，CsA还用于难治性肾病综合征的治疗，取得了良好的效果。但CsA的一些严重不良反应尤其是肾间质纤维化的慢性肾毒性限制了该药的应用［1］。研究发现，CsA诱导氧化应激产生过多的活性氧(Reactive oxygen species，ROS)是CsA慢性肾毒性发病机制之一［1］。银杏叶标准提取物(Ginkgo biloba extract，EGb)具有抗氧化作用，我们以前的研究发现其具有减轻氧化应激反应，减轻纤维化，具有肾脏保护作用［3］，但EGb对于CsA慢性肾损伤的作用机制尚不清楚。本实验建立CsA慢性肾损伤动物模型，观察肾小管间质细胞凋亡、细胞周期蛋白p27的表达及EGb对其的影响，以期为寻找有效的防治CsA肾毒性的药物提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 主要材料及仪器

雄性Wistar大鼠20只，体质量200～230 g，购自并饲养于复旦大学医学院实验动物中心(SPF级)。CsA购自瑞士诺华公司，EGb(含黄酮甙24.1%，银杏苦内酯9.1%)由上海信谊百路达药业有限公司提供。细胞凋亡检测试剂盒I(POD)购自武汉博士德生物公司，兔抗大鼠p27多克隆抗体购自美国Santa Cruz公司，辣根过氧化物酶标记的羊抗兔第二抗体、3，3-二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒均购自洛阳华美公司。UV-2102 PCS型紫外可见分光光度仪(德国Unicon)，低温高速离心机(美国Beckman)，光学显微镜(日本Olympus)。

1.2 CsA慢性肾毒性模型的建立及分组

选用雄性 Wistar大鼠20只，体质量 200～230 g，饲养环境温度维持在(20±2)℃，相对湿度(40% ～60%)，光照12 h，自由进食、饮水，大鼠适应性正常饲养1周。随机分为5组:(1)对照组:4只，予CsA溶剂(橄榄油)皮下注射;(2)小剂量CsA模型组:4只，CsA以橄榄油稀释，按每日25 mg/kg皮下注射;(3)大剂量CsA模型组:4只，CsA按每日50 mg/kg剂量皮下注射;(4)小剂量CsA+EGb治疗组:4只，每日25 mg/kg CsA皮下注射同时，予EGb每日(300 mg/kg，用生理盐水配制成4%的悬浊液)灌胃;(5)大剂量CsA+EGb治疗组:4只，每日50 mg/kg CsA皮下注射同时，予EGb每日(300 mg/kg，用生理盐水配制成4%的悬浊液)灌胃。以上各组分别给药4周，实验结束时处死动物，收集24 h尿，动物处死前禁食12 h，准确称取体重。动物处死后腹主动脉取血5 ml，取血清采用罗氏Modular P800全自动生化分析仪检测血肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)、尿蛋白、尿肌酐，计算24 h尿蛋白定量。双肾分离后，左肾剥去包膜置于4%多聚甲醛缓冲液固定，制作石蜡切片;右肾置于液氮中保存，用于制备肾组织匀浆液。

1.3 Masson染色观察肾组织病理改变

石蜡切片常规脱蜡至水，采用Masson三色染色法观察肾小管间质纤维化情况。200×镜下每张切片采集30个不重复视野，用北航医学病理图像分析软件自动分析系统根据病变的百分数判定积分:0为无病变;0.5为＜5%(每视野);1为5%;1.5为16%;2为26%;2.5为36% ～45%;3为＞45%。将呈现为蓝色的区域作为阳性目标，以阳性面积与统计总面积的比值作为肾小管间质纤维化的评分标准。

1.4 免疫组化观察肾脏p27表达水平

肾组织石蜡切片常规脱蜡至水，1.5%H2O2－甲醇去除组织中的内源性过氧化物酶，微波消化修复抗原，滴加1%BSA封闭，滴加兔抗大鼠p27第一抗体(1∶100稀释);以1%BSA替代一抗作空白对照，4℃过夜，滴加辣根过氧化物酶偶联的二抗(抗兔，1∶200)，DAB显色。每张切片在200×光镜下随机选取30个不重复的视野，计数p27阳性细胞数，结果以阳性细胞数/细胞总数的百分比表示。

1.5 肾组织细胞凋亡检测

采用Tunel方法，操作步骤按说明书介绍进行。TUNEL标记的阳性细胞为核着黄色或棕黄色为凋亡细胞。在低倍镜(10×10)下随机选取至少30个不重复的视野，计数凋亡阳性细胞数，结果以阳性细胞数/细胞总数的百分比表示。

1.6 统计学处理

用SPSS12.0软件对结果中的数据进行统计学处理，实验数据以±s表示，组间比较采用单因素方差分析，以P＜0.05为有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组体质量、尿量、肾功能及尿蛋白水平

如表一所示，与对照组相比，所有CsA模型组和EGb治疗组体质量均明显下降(P＜0.05)，CsA大剂量(50 mg)+EGb治疗组体质量较CsA大剂量(50 mg)模型组明显增加(P＜0.05)。同样，与对照组相比，所有CsA模型组和EGb治疗组动物24 h尿蛋白定量均明显增加(P＜0.05)，而EGb治疗后可明显降低尿蛋白水平(P＞0.05)，但CsA小剂量模型组与大剂量模型组间无显著性差异(P＞0.05)。其他各项指标包括尿量和Scr和BUN水平，与对照组相比，所有CsA模型组和EGb治疗组均明显增加(P＜0.05)，但CsA模型组和EGb治疗组之间无明显差异(P＞0.05)，见表1。

表1 各组体质量、尿量、肾功能及尿蛋白水平Tab.1 Body weight，urine volume，renal function and urinary protein in 24 h in each group

2.2 各组肾脏组织学改变

Masson染色显示，CsA处理大鼠后，肾小管上皮细胞充血肿胀，肾小管上皮细胞变性、坏死，可见蛋白管型;间质炎症反应，间质细胞增生，间质纤维化评分明显增高(P＜0.05)，CsA大剂量组较小剂量组病变加重。而以上改变在EGb组中有不同程度减轻。见图1、表2。

表2 各组肾间质纤维化评分Tab.2 Score of renal interstitial fibrosis in each group

2.3 各组肾组织中细胞凋亡情况

正常对照组肾组织中凋亡细胞非常少见，而在所有CsA模型组和EGb治疗组肾组织中可见大量的核深染，呈棕色的凋亡细胞，较正常对照组明显增高(P＜0.05)，其中CsA大剂量模型组凋亡细胞百分比较CsA小剂量模型组明显升高(P＜0.05)，而EGb治疗组凋亡细胞百分比较CsA模型组明显下降(P＜0.05)，见图2、表 3。

表3 各组凋亡细胞百分比及p27阳性细胞百分比Tab.3 Percentage of cell apoptosis and p27 expression in renal tissues

2.4 各组肾组织中p27表达情况

与正常对照组相比，所有CsA模型组和EGb治疗组肾组织中p27阳性细胞百分比明显增加(P＜0.05)，其中CsA大剂量模型组较CsA小剂量模型组明显升高(P＜0.05)，而EGb治疗组p27阳性细胞百分比则较CsA模型组明显减少(P＜0.05)。见图3。此外，p27阳性细胞百分比与凋亡阳性细胞百分比呈明显正相关(R=0.9594，P＜0.05)。见表 3、图4。

3 讨 论

CsA是器官移植和治疗某些自身免疫性疾病的免疫抑制剂。但过量和长期应用可导致肾间质条状纤维化，肾小管萎缩，肾小球动脉透明样变性等肾损伤，研究发现近30%的CsA使用者会出现中度或重度肾毒性［4-5］。虽然CsA引起肾毒性的机制尚不完全清楚，但可能与激活肾素-血管紧张素(reninangiotensin system，RAS)系统、转化生长因子-β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)、肾细胞凋亡、血管活性介质如血栓素A2(Thromboxane，A2)与白三烯(Leukotriene)、活性氧等有关［6］。

本研究中CsA模型组和EGb治疗组尿蛋白均明显增加，虽然小剂量模型组Scr较对照组升高，而大剂量模型组较对照组无改变，分析其原因可能为血Scr与肌肉含量有关，大剂量模型组体重减轻明显，故血肌酐无明显上升，而CsA模型组和EGb治疗组Ccr均下降;组织学上可见肾小管充血肿胀，肾小管上皮细胞变性、坏死，可见蛋白管型;间质炎症反应，间质细胞增生，间质纤维化评分明显增高，且随剂量增加病变更为严重，与其他研究报道一致［7］。

细胞凋亡是细胞在基因控制下的生理性程序化死亡，主要是通过启动内源性DNA内切酶的活性而发生的细胞自然死亡过程。机体通过凋亡清除损伤、衰老和突变的细胞，维持生理平衡。过度凋亡导致细胞构成的损失，留下的空间被细胞外基质替代，并影响机体对损伤区域内的组织细胞修复能力，可促进间质的纤维组织增生。本部分研究发现，CsA小剂量和大剂量模型组肾组织中凋亡细胞明显增加，且与剂量相关，说明CsA可导致以肾小管间质细胞为主的肾细胞凋亡，形成肾间质纤维化，是导致CsA慢性肾毒性的发病机制之一。体外研究表明，CsA可以直接引起肾小管细胞LLC-PK1凋亡;在CsA慢性肾毒性动物模型中也发现，肾小管间质损伤区域凋亡细胞明显增多，且与给药的剂量和时间呈正相关，均支持本研究结论。

p27是一种周期素依赖性激酶抑制蛋白，通过抑制CDK或细胞周期蛋白E/CDK复合物的活性来调控细胞周期的进程，限制细胞通过G1/S点，为细胞周期负性调控因子，更作为凋亡的始动因子诱导细胞凋亡。体外试验中发现p27过度表达可诱导癌细胞凋亡。p27促进凋亡的作用可能与其导致的多聚核酶的裂解和CyclinB1的降解有关。应用免疫组化方法发现早期胃癌组织中p27着色指数与凋亡指数显著相关。本研究发现，CsA模型组p27阳性细胞百分比明显增加，随着给药剂量增加p27阳性细胞百分比增加，且与细胞凋亡百分比呈正相关。体外研究表明，CsA可引起细胞周期发生改变:G0/G1期细胞增多，DNA合成减少，S及G2/M期细胞减少。因此，推测CsA上调了周期素依赖性激酶抑制蛋白p27表达，阻止细胞通过G1/S限制点，G0/G1期细胞增多，肾小管上皮细胞凋亡增加，参与CsA慢性肾毒性发生发展。

EGb是从银杏叶中提取的复方组分，其主要有效成分为银杏黄酮甙类(Ginkgoflavone glycosides)、银杏内酯(Ginkgolides)和白果内酯等。EGb具有广泛的药理学作用:如清除自由基，抑制脂质过氧化;保护线粒体氧化磷酸化;影响血管内皮细胞因子和儿茶酚胺的释放;拮抗血小板活化因子受体;抗炎以及调节血脂代谢紊乱等。我们以往研究发现，EGb可能通过抑制氧化应激反应而拮抗高糖和 AGEs诱导的 TGF-β1、结缔组织生长因子(CTGF)、纤维连接蛋白(Fn)的过表达［8］。EGb 以浓度依赖方式抑制TGF-β1诱导的HKC表型转化，下调单核细胞趋化蛋白(MCP-1)表达［9］。根据EGb的药理作用推测其可能对CsA慢性肾毒性有防治作用，但国内外尚未见相关报道。本研究发现EGb治疗组与CsA模型组相比尿蛋白水平明显下降，组织学检查肾间质纤维化评分提示EGb治疗组较CsA模型组有不同程度减轻，经EGb治疗后，肾小管间质细胞周期素依赖性激酶抑制蛋白p27表达下降，细胞凋亡减少。表明EGb可减少细胞凋亡，减轻CsA导致的肾小管变性坏死，肾间质纤维化，而发挥肾脏保护作用。

综上所述，本研究发现CsA使肾小管上皮发生细胞周期阻滞，诱发以肾小管间质细胞为主的肾细胞凋亡可能是CsA慢性肾毒性发病机制之一。EGb可减少细胞凋亡，减轻CsA导致的肾小管变性坏死，肾间质纤维化，从而减轻肾毒性。因此，认为EGb制剂有可能作为辅助药物减少CsA的肾毒性，从而使CsA能更安全、长期应用于临床治疗。

［1］Xiao Z，Li C，Shan J，et al.Mechanisms of renal cell apoptosis induced by cyclosporine A:a systematic review of in vitro studies［J］.Am J Nephrol，2011，33(6):558－66.

［2］李洲斌，韩晨俊.小剂量环孢素对大鼠心脏移植的免疫抑制效果［J］.同济大学学报:医学版，2010，31(4):9－11.

［3］江薇，李雪竹，郑美芬，等.银杏叶提取物对环孢素A慢性肾毒性的拮抗作用［J］.上海医学，2009.32(3):226－229.

［4］刘奕明，林爱华，邓时贵，等.环孢素A诱导的大鼠慢性肾毒性变化及与血药浓度的关系［J］.广东医学.2009，30(1):29 －31.

［5］Krejci K，Tichy T，Bachleda P，et al.Calcineurin inhibitor-induced renal allograft nephrotoxicity［J］.Biomed Pap Med Fac Univ Palacky Olomouc Czech Repub，2010，154(4):297 －306.

［6］Naesens M，Kuypers DR，Sarwal M.Calcineurin inhibitor nephrotoxicity［J］.Clin J Am Soc Nephrol，2009，4(2):481 －508.

［7］Servais H，Ortiz A，Devuyst O，et al.Renal cell apoptosis induced by nephrotoxic drugs:cellular and molecular mechanisms and potential approaches to modulation［J］.Apoptosis，2008，13(1):11 －32.

［8］Yan Hai-dong，Li Xue-zhu， Xie Jun-mei， et al.Effects of advanced glycation end products on renal fibrosis and oxidative stress in cultured NRK-49F cells［J］.Chinese Medical Journal(Engl)，2007，120(9):787－793.

［9］刘娜，严海东，徐太静.银杏叶提取物在TGF-β1诱导的人肾小管上皮细胞表型转化中的作用研究［J］.中国中西医结合肾脏病杂志，2008，9(3):206－209.