MMP-9、TIMP-1在心力衰竭幼鼠心肌中的表达

梅 峻，谷 丽，陆凤凤，杨 蓉

(同济大学附属第十人民医院儿科，上海 200072)

目前，认为小儿慢性心力衰竭(chronic heart failure，CHF)发生是由心室重塑引起。基质金属蛋白酶(MMPs)是降解细胞外基质成分的主要蛋白水解系统，金属蛋白酶组织抑制因子(TIMPs)是(MMPs)的内源性特异性抑制剂，本文拟通过建立后负荷过高的慢性心力衰竭幼鼠实验模型，用免疫组化法检测心力衰竭幼鼠心肌MMP-9、TIMP-1的表达，以探讨 MMP-9、TIMP-1在心室重塑中的作用。

1 材料与方法

1.1 动物模型制作及实验分组

60只雄性5～6周龄Wistar幼鼠，对照组10只(仅开腹并分离腹主动脉，但不予以结扎)，余50只采用肾上腹主动脉缩窄法制作慢性心力衰竭模型，喂养5周后，死亡22只，余28只幼鼠中有18只出现明显心力衰竭表现，随机抽取这18只幼鼠中的10只行血流动力学测定，证明均达到心力衰竭(左室舒张末压≥15 mmHg)［2］，作为心力衰竭组，检测血流动力学参数，用Masson染色法观察左室心肌胶原形态，图像分析测量胶原容积分数(CVF)和血管周围胶原面积(PVCA)，免疫组化法检测心室肌中MMP-9、TIMP-1表达。

1.2 血流动力学检测

观察期满后测血流动力学指标。10%乌拉坦腹腔麻醉，导管内充满肝素，右颈总动脉逆行插管至左心室，另一端接多媒体生物信号记录仪系统，记录分析后得左室舒张末压(LVEDP)。

1.3 检测指标

1.3.1 血流动力学指标 9周后测左室舒张末压(LVEDP)。

1.3.2 幼鼠心肌细胞和胶原的定性和定量分析取左室纵截面心肌组织，常规固定、包埋和制片，进行MASSON染色:在MASSON染色下心肌细胞呈红色，胶原呈蓝色。采用 Biosens Digital Imaging System医学图像分析系统，测量心肌胶原容积分数(CVF)及心肌血管周围胶原面积和管腔面积之比(PVCA)。其中CVF=心肌胶原面积/所测视野面积，PVCA=小动脉管腔周围胶原面积/管腔面积，每张心肌切片标本均随机取4个视野测量，取平均值。

1.3.3 免疫组织化学检测 兔抗大鼠MMP-9多克隆抗体购自北京中杉金桥生物公司，TIMP-1抗体购自武汉博士德生物工程公司。sp免疫组织化学试剂盒购自北京中杉金桥生物公司。免疫组化方法按说明书进行。

1.4 数据处理

数据以±s表示，组间差异采用方差分析进行统计学处理，P＜0.05或P＜0.01认为具有统计学显著性意义。

2 结 果

2.1 各组幼鼠一般状态变化

模型制作5周后对照组幼鼠一般状态正常，模型组幼鼠出现明显心力衰竭表现。

2.2 各组幼鼠的血流动力学及心肌纤维化指标的变化(表1)

表1 各组幼鼠LVEDP、CVF、PVCA的变化Tab.1 Changes of LVEDP，CVF，PVCA in 2 groups of juvenile rats

由表中数据可知，心力衰竭组幼鼠与对照组幼鼠相比，LVEDP显著升高，各指标具有统计学意义(P＜0.01)，说明心力衰竭模型制作成功，心力衰竭组幼鼠心肌收缩和舒张能力下降。心力衰竭组幼鼠同对照组相比，心室肌纤维排列紊乱，心肌细胞肥大，间质中可见基质沉积，血管周围可见反应性纤维化，反映心室重塑的指标CVF、PVCA差别有统计学意义(P＜0.01)。

2.3 各组幼鼠心肌 MMP-9、TIMP-1表达的变化(表2)

表2 各组幼鼠心肌MMP-9、TIMP-1平均灰度值的比较Tab.2 Comparison of the average value of MMP-9 and TIMP-1 in rat myocardium

MMP-9在对照组幼鼠心肌细胞胞浆内表达较弱，在心力衰竭组强阳性表达，两组相比差别有统计学意义(P＜0.01)。TIMP-1在心力衰竭组幼鼠心肌细胞胞浆内表达较对照组明显减弱，差别有统计学意义(P＜0.01～0.05)。MMP-9/TIMP-1比值在心力衰竭组幼鼠明显高于对照组，差别有统计学意义(P＜0.01)。

3 讨 论

MMP-9是由Sopata和Dancewica在1974年从人的中性粒细胞中首次提纯，1989年的金属蛋白酶学会上被正式命名。分子量92 KDa，是已发现的MMPs中分子量最大的酶。主要由成纤维细胞、单核细胞及嗜中性粒细胞合成［3］。TIMP-1(28 KD)广泛存在于组织和体液中，被多种细胞因子(IL-1，TGF-d等)诱导表达，与胶原酶和明胶酶有高亲和性，是MMP-9的特异抑制因子，是体内调节MMP-9活性的重要内生性抑制系统［4］。

越来越多的实验及临床研究证明MMP-9水平的增高在心室重塑中起着非常重要的作用［5］，研究发现，MMP-9对基底膜的过度的降解会影响心肌细胞的空间排列和组合［6］。心房颤动时，MMP-9表达增加可导致心房肌细胞外基质的过度降解，使心房肌细胞对机械牵张抵抗力下降，并易于扩张。Khan等在快速心室起搏诱导的犬的心力衰竭模型中发现，在心力衰竭发展的不同阶段左房、右房压力及左房壁张力指数均显著增高，心力衰竭末期心房肌细胞肥大，心房胶原合成和降解增加，胶原纤维排列紊乱。在心室扩张伴心力衰竭鼠模型心脏中MMP-9活性显著增强。心肌梗死后，移除MMP-9基因的小鼠，左心室的扩张程度明显减低。这是因为MMP-9活性增高导致过度降解细胞外基质，降解正常的胶原蛋白，结果被纤维性间质所取代，造成心肌收缩的协调性减弱，最终导致心室壁变薄和心腔扩张［7］。既往研究发现慢性心力衰竭时MMP-9表达水平增高与以下因素有关:①TIMP的抑制作用。研究表明 MMP-9与TIMP-1关系密切，机理推测TIMP-1可能通过第17-19位的亮氨酸一撷氨酸一异亮氨酸与MMP-9的S1'-S2'-S3'区结合，从而抑制其活性［8］。②细胞外基质金属蛋白酶诱导物(EMMPRIN)，把人心肌成纤维细胞暴露于重组的EMMPRIN时，可诱导MMPs的表达［9］。③肾素—血管紧张素—醛固酮系统(RAAS)激活。慢性心力衰竭时，神经内分泌系统的激活，使RAAS活性增高，通过收缩阻力血管维持血压及刺激醛固酮分泌导致水钠潴留，从而维持心输出量和重要器官供血。如果心力衰竭病因不能及时清除，循环中血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)水平的持续增高，通过一系列复杂的机制增加MMP-9的表达［10］。

研究发现，TIMP-1的正常表达是维持正常的心脏结构所必需的，TIMP-1基因敲除的大鼠心肌梗死后左室显著扩张，心脏超声显示其左室舒张末容积增加18%，心脏重量增加38%。随心力衰竭加重，心肌TIMP-1 mRNA表达下调。免疫组化发现，心力衰竭末期心肌标本TIMP-1显著下降。另有研究表明TIMP-1可能通过细胞表面的TIMP-1受体起作用，具有抗凋亡促生长的作用。由于TIMP-1的减少，抗凋亡促生长的作用减弱，造成心肌细胞凋亡增加，加重心室重构过程。本试验研究也表明在幼鼠衰竭心脏中TIMP-1表达水平是降低的［11］。

本实验成功建立了充血性心力衰竭幼鼠动物模型，发现与对照组幼鼠相比，心力衰竭组幼鼠心肌中MMP-9、MMP-9/TIMP-1的比值增高，提示MMP-9、TIMP-1表达水平的变化与心室重塑的形成可能有关。本试验研究表明，MMP-9/TIMP-1相互作用的失衡参与了心力衰竭幼鼠心室重塑的发病过程。

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