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动脉粥样硬化兔锁骨下动脉盗血模型的磁共振波谱分析

2012-07-20姜立先张桂运陈左权陈路佳

同济大学学报(医学版) 2012年6期
关键词:高脂代谢物锁骨

姜立先,张桂运,陈左权,陈路佳,薛 飞

(1.同济大学附属第十人民医院神经外科,上海 200072;2.同济大学附属同济医院神经外科,上海 200065)

慢性脑低灌注所导致的缺血性脑血管疾病,成为目前研究的重要方向[1-3]。永久性双侧颈总动脉结扎(two-vesselsocclusion,2VO)是研究慢性脑缺血较为常用的动物模型方法,一些研究显示,在大鼠双侧颈总动脉结扎的慢性脑缺血模型中,发生了神经化学变化[4]。但该法结扎后急性缺血明显、模型动物死亡率高。前期通过高脂饮食新西兰大白兔,采用手术结扎法制成了动脉粥样硬化兔锁骨下动脉盗血模型,模拟临床动脉粥样硬化患者由于动脉狭窄或闭塞导致的大脑后循环低灌注状态[5-7]。本实验在动脉粥样硬化兔锁骨下动脉盗血模型基础上,采用离体高分辨魔角旋转磁共振波谱(HRMAS1HNMR)技术,对慢性脑低灌注下所导致的多种神经代谢物质的改变进行测定并观察其变化意义。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

将24只雄性新西兰大白兔,体质量3.0~3.5 kg,普通级,由同济大学动物实验中心提供,随机分为普通饮食对照组8只,高脂饮食组8只,高脂饮食盗血模型组8只。高脂喂养饮食配方为89%基础饲料+1%胆固醇+5%蛋黄+5%猪油,持续喂养12周。

1.2 锁骨下盗血模型建立

采用结扎法建立右侧锁骨下盗血模型[5-6]。用3%戊巴比妥钠,以1 ml/kg耳缘静脉缓慢注射麻醉。待兔睫毛反射消失后,使用8%硫化钠颈胸部脱毛,常规消毒铺巾。1%利多卡因局部麻醉后,沿胸骨右缘取4.5 cm长直行切口,切口下缘止于胸锁关节。逐层分离皮下组织和颈部肌肉,分离出颈总动脉鞘,暴露右侧颈总动脉,以颈总动脉为标记,沿其向近心端分离,直至右侧无名动脉和锁骨下动脉显露满意(所有骨性结构保留完整)。紧贴右侧颈总动脉开口,在其右侧双重结扎锁骨下动脉(4-0的手术线)。术毕逐层缝合肌肉和皮肤,局部消毒包扎。术后每天肌内注射头孢替安1次,每次0.5 g,连续3 d。结扎后1周在全身麻醉下,行主动脉弓、左侧椎动脉和双侧颈内动脉造影,确认右侧锁骨下动脉盗血和后循环低灌注状态。动脉粥样硬化兔造模成功的标准为,病理检查兔的主动脉弓有大量斑块形成,有部分兔的颈动脉分叉部斑块形成。

1.3 标本采集

将模型制作成功新西兰大白兔于3个月后空气栓塞处死,普通饮食对照组及高脂饮食组饲养12周后处死,快速断头取脑,分别取两侧海马的脑组织,每个标本分成两部分,一部分置入液氮速冻后保存在-80℃低温冰箱中用于HR-MAS1HNMR分析,另一部分放入4%多聚甲醛溶液固定。并取出颈总动脉分叉处和主动脉弓处的血管,置入4%多聚甲醛溶液固定,常规进行石蜡包埋、切片。

1.4 1H MRS 分析

样品从低温冰箱取出,经重水淋洗后,取15 mg样品装入外径4 mm附带球形内腔的Zr02转子中,在 BRUKER AVANCEⅡ-600 MHz(14.1 T)波谱分析仪上进行分析。1H共振频率为600.13 MHz,测试用探头为高分辨魔角旋转头(high-resolution magic angle spinning,HR-MAS),魔角转速5 kHz,测试温度300.0 K。谱图采样点数65 K,谱宽12 KHz,弛豫延迟2秒,累加次数256次,采用的脉冲序列是CPMG序列,同时用预饱和法压制水峰。采集到的数据(FID)通过傅里叶变换,处理的窗函数(lb)为1.0,所有的数据利用Bruker公司的Topspin 2.1软件系统进行自动相位和基线校正处理,然后以乳酸双峰(Lac:δH 1.32 ~1.34 ×10-6)的化学位移值作为内标进行定标,分别得到不同的高分辨魔角旋转氢谱。所得谱图采用Topspin 2.1软件分析,计算不同神经代谢物的磁共振波峰峰值积分。检测的神经代谢产物主要为:N-乙酰-天冬氨酸复合物(NAA)、胆碱(Cho)、肌酸/磷酸肌酸(Cre)、乳酸(Lac)、γ-氨基丁酸(GABA)、谷氨酸(Glu)等。

1.5 统计学分析

数据以±s表示,所有数据经正态检验和方差齐性分析,符合检验要求后两组间比较采用单因素方差分析,以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 HR-MAS1HNMR 氢谱分析

模型组左侧海马组织的氢谱显示NAA、GABA出现大幅下降,Glu上升显著,Asp、Gly分别出现上升和下降;而Cho、Lac变化不明显(图1);右侧海马组织氢谱与左侧类似(图2)。高脂饮食组海马组织氢谱的变化不明显(图1、2)。

2.2 代谢物的含量变化

表1表示三组兔双侧海马代谢物峰的积分均值及标准差,用单因素方差分析可知,模型组与普通饮食对照组及高脂饮食组比较有三种代谢物(NAA、Glu、GABA)比较差异有统计学意义(P<0.05),普通饮食对照组与高脂饮食组神经代谢物比较差异无统计学意义(P>0.05)。

图3提示相对于普通饮食对照组及高脂饮食组,模型组海马 NAA、GABA、Gly、Cre四种代谢物的含量出现下降,而Glu、Asp、Cho三种代谢物的含量则上升。

表1 三组兔海马组织各代谢物峰的变化Tab.1 Metabolites changes in rabbit hippocampus of 3 groups (x±s)

3 讨 论

大量研究证明,海马是脑缺血损伤最敏感的区域之一[9],而大脑后动脉是兔海马的主要供血动脉[10]。本实验采用动脉粥样硬化兔锁骨下动脉盗血模型,模拟临床动脉粥样硬化患者由于动脉狭窄或闭塞导致的大脑后循环慢性低灌注状态[5-7],观察海马的神经代谢变化。

高分辨魔角旋转核磁共振(HR-MAS1HNMR)技术能检测到大脑中十几种代谢物的变化,能够得到活体磁共振检测不到的多种氨基酸的信息[11]。主要的检测指标包括:NAA、Cho、Cre、Lac、Glu、Asp、GABA、Glv等。

N-乙酰天冬氨酸(NAA)主要存在神经元和轴突内,可以反映神经元的数量和动能。本实验结果显示在大脑后循环慢性低灌状态下,神经元标志物NAA水平显著降低,提示大脑慢性低灌注后海马神经元数量和(或)功能状态的明显降低。舒细记等[12]采用2VO术,使大鼠大脑持续性低灌注6个月后在体1HRMAS检测海马NAA含量,发现大鼠双侧海马的NAA/Cr比值显著下降。胆碱(Cho)包括磷酸胆碱、磷脂酰胆碱及磷酸甘油胆碱,是细胞膜磷脂代谢的成分之一,参与细胞膜的合成和髓鞘的降解。王金月等[13]对临床上诊断为慢性脑缺血患者的低灌注区行单体素质子磁共振波谱扫描发现,胆碱/肌酸(Cho/Cr)比值较对侧上升,而舒细记等[12]报道Cho水平下降。本研究结果显示,模型组海马Cho含量未发生明显改变。陈晓晴等[14]发现,大鼠2VO术2个月后,丘脑胶质细胞数目明显增加,推测Cho含量未发生明显改变与大量胶质细胞增生有关。肌酸(Cre)包括肌酸、磷酸肌酸,在正常代谢情况下,总肌酸浓度基本保持稳定;乳酸(Lac)信号的出现代表糖酵解增大或者其他代谢产物累积。模型组Cre、Lac无明显变化,提示能量代谢未受到明显影响。推测在慢性脑血流低灌注状态下,激活了体内能量代谢的代偿机制。

本实验发现,在大脑后循环慢性低灌状态下,相对于普通饮食对照组和高脂饮食组,Glu显著增高,GABA显著降低。Glu、Asp是兴奋性氨基酸,它们的释放可产生神经毒性作用;GABA和Glv是抑制性氨基酸,能抑制神经兴奋,对神经毒性起一定的保护作用。有研究表明,通常情况下,兴奋性氨基酸和抑制性氨基酸是处于一个动态平衡之中,在病理状态下上述平衡被破坏,兴奋性氨基酸过度释放,且谷氨酸受体介导的兴奋毒性作用可引发神经元的凋亡[15-16]。脑内GABA是Glu经谷氨酸脱羧酶脱羧生成,它作为主要抑制性神经递质,可以拮抗缺血引起的谷氨酸兴奋毒性,保护神经元的损伤[17]。抑制性氨基酸(主要是GABA)虽可拮抗兴奋性氨基酸的毒性,但脑损伤后抑制性氨基酸代偿性过度释放,抑制其自身合成,导致 GABA能神经元功能障碍[18]。

相对于活体磁共振波谱而言,高分辨魔角旋转核磁共振(HR-MAS1HNMR)技术分辨率更高,更能准确地反映慢性低灌注脑组织的生化改变。本实验发现,动脉粥样硬化兔锁骨下动脉盗血模型对海马神经元代谢变化影响显著,神经元数量或功能降低(NAA下降),同时产生兴奋性神经毒性(Glu升高)。揭示在慢性低灌注下,神经元代谢功能受损,为动脉粥样硬化性脑缺血的研究提供了可靠的实验理论依据。

[1]Yoshizaki K,Adachi K,Kataoka S,et al.Chronic cerebral hypoperfusion induced by rightunilateral common carotid artery occlusion causes delayed white matter lesions and cognitive impairment in adult mice[J].Exp Neurol,2008,180:3492 -3501.

[2]Zheng P,Zhang J,Liu H,et al.Angelica injection reduces cognitive impairment during chronic cerebral hypoperfusion through brain-derived neurotrophic factor and nerve growth factor[J].Curr Neurovasc Res,2008,5:13 -20.

[3]Farkas E,Luiten PG,Bari F.Permanent,bilateral common carotid artery occlusion in the rat:a model for chronic cerebral hypoperfusion-related neurodegenerative diseases[J].Brain Res Rev,2007,54:162 -180.

[4]HirabayashiH, Kurita D, Takizawa S, etal.Phosphate-related energy compounds are not exhausted in chronically hypoperfused ratbrain cortex after cortical spreading depression[J].Stroke Cerebrovasc Dis,2004,13:271 -279.

[5]张桂运,陈左权,凌锋,等.动脉粥样硬化兔锁骨下动脉盗血模型的建立[J].中国脑血管病杂志,2009,6(7):355-358.

[6]ZHANG Gui-yun,Chen Zuo-quan,Ling Feng,et al.Establishmentof a novel hemodynamic cerebral ischemia model of atherosclerotic rabbit[J].Neurol India,2010,58(2):191 -194.

[7]张桂运,王硕,王岩,等.动脉粥样硬化兔不同程度血液动力性脑缺血模型的建立[J].同济大学学报:医学版,2011,32(2):15 -18.

[8]李建章.慢性脑供血不足新思维[J].中国实用神经疾病杂志,2007,10(5):1 -5.

[9]Sayan-Oacmak,H,Ozacmak VH,Barut F,et al.Rosiglitazone treatment reduces hippocampal neuronal damage possibly through alleviating oxidative stress in chronic cerebral hypoperfusion[J].Neurochemistry International,2012,61(3):287 -290.

[10]付强,王增贤.体视学方法在家兔海马血管构筑的研究初探[J].西藏大学学报,2002,17(3):1.

[11]Maria RM,Moraes TB,Magon,Claudio Jose;et al.Processing of high resolution magic angle spinning spectra of breast cancer cells by the filter diagonalization method[J].The Analyst,2012,137(19):4546-4551.

[12]舒细记,柳威,周红艳,等.慢性脑缺血大鼠海马质子磁共振波谱分析[J].中华行为医学与脑科学杂志,2010,19(6):522 -523.

[13]王金月,刘筠,钟进,等.慢性脑缺血患者脑血流动力学与脑代谢改变的影像学研究[J].实用放射学杂志,2010,26(8):1079 -1083.

[14]陈晓晴,向赟,罗小平.慢性脑缺血对大鼠丘脑神经代谢物质的影响[J].解剖学研究,2008,30(2):101-104.

[15]Takada Y,Yonezawa A,Kume T,et al.Nicotinic acetylcholine receptormediated neuroprotection by donepezil against glutamate neurotoxicity in rat cortical neurons[J].Pharmacol Exp Ther,2003,306(2):772-777.

[16]郭小立,金英.阿魏酸钠对抗谷氨酸诱导的鼠皮层神经元凋亡作用的影响[J].中国现代医药杂志,2012,14,(2):22 -25.

[17]解登梅,刘晓晴,李梅,等.缺血性脑卒中与神经递质的关系[J].中外医学研究,2011,9,(15):154 -157.

[18]Glodzik-Sobanska L,Slowik A,Kozub,j,et al.GABA in ischemic stroke.Proton magnetic resonance study[J].Medical Science Monitor:International Medical Journal of Experimental and Clinical Research,2004,10(3):88 -93.

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