猪圆环病毒2型ORF3基因的克隆及原核表达

杨晓燕，刘 航，杨顺利，尹双辉，尚佑军，田永强

（1.兰州交通大学化学与生物工程学院，甘肃 兰州 730070；2.中国农业科学院兰州兽医研究所，家畜疫病病原学国家重点实验室，甘肃 兰州 730046）

猪圆环病毒（Porcine circovirus，PCV）是目前发现的最小的动物病毒[1]，属于圆环病毒科（Circoviridae）圆环病毒属（Circovirus），病毒基因组为无囊膜的单股环状DNA病毒。病毒颗粒平均直径为17nm，呈20面体对称[2]。根据PCV的致病性、抗原性及核苷酸序列，将PCV分为PCV1和PCV2两个基因型，基因组大小约为1.7kb，其中PCV1对猪为非致病性，但广泛存在猪体内及猪源代细胞系。PCV2感染常常被认为可引起断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）、皮炎肾病综合征、增生性坏死性肺炎、猪繁殖与呼吸综合征、仔猪传染性先天性震颤等多种疾病，但临床上以PMWS最为常见[3-5]。

PCV2的ORF3基因是除ORF1、ORF2外较大的阅读框[6]，位于基因组671～357 bp位碱基(复制起始点作为序列起始)，大小为314 bp，编码104个氨基酸。ORF3对应着ORF1（Rep蛋白氨基酸103～207 aa）的反向互补序列和Cap蛋白B淋巴细胞抗原表位（185～211 aa），与ORF2蛋白的一个 T淋巴细胞抗原表位共用201～211 aa，功能尚不完全清楚[8]。而其他阅读框编码产物的功能和特性目前尚不清楚。为了探讨ORF3基因结构及其与功能的关系，研究以实验室分离的PCV2菌株为材料，对ORF3基因进行完整克隆，并在大肠杆菌中克隆表达。

1 材料与方法

1.1 病毒、菌株与基因

实验室保存的从临床表现为PMWS仔猪脾脏中分离的PCV2毒株；大肠杆菌 JM109，BL21（DE3）菌株，载体 pGEX-6p-1（Invitrogen公司）。

1.2 酶与试剂

引物、PCR试剂、DNA片段回收试剂盒、质粒提取试剂盒（大连宝生物有限公司）；T4 DNA连接酶、BamH I、Sal I限制性内切酶，Taq酶（promega公司）；核酸 Makers，蛋白 Makers，TMB，辣根过氧化物酶标记兔抗猪IgG抗体（Sigma公司），其他试剂均为国产分析纯试剂。

1.3 引物设计与目的基因的PCR扩增

按照Genbank中PCV2 ORF3的序列，设计一对特异性引物，引物序列如下：

P1：5′-TTCGGATCCATGGTAACCGTCCCACCACT-3′

P2： 5′-CTGGTCGACCCTGATGGAATGTGGAGC-3′

为了便于克隆，在引物P1中加入了BamH I酶切位点，在P2中加入了Sal I酶切位点，同时为了方便表达及表达产物的纯化，删去了终止密码子，引物由上海生工合成。PCR扩增反应条件：95℃5 min，94℃变性 1 min，55℃退火 40 s，72℃延伸 50 s，循环30次后，最后72℃延伸10 min。扩增产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳分析，用DNA回收试剂盒回收PCR产物。

1.4 原核表达载体的构建

将回收的PCV2 ORF3基因片段与载体pGEX-6p-1分别用BamH I+Sal I双酶切，用T4 DNA连接酶将ORF3克隆到载体pGEX-6p-1中。连接产物转化入大肠杆菌JM109感受态细胞，经BamH I+Sal I双酶切及PCR鉴定，筛选出重组质粒，命名为pGEX-6p-1-ORF3。将重组质粒pGEX-6p-1-ORF3送上海生工进行测序。

1.5 ORF3基因的诱导表达及其可溶性分析

将重组质粒pGEX-6p-1-ORF3转化大肠杆菌BL21（DE3）菌株中，将含有重组质粒的单菌落在新鲜的 5mL LB 培养基（含 100 μg/mL，Amp+），37℃振荡培养过夜（180 r/min），阴性对照为含空白载体pGEX-6p-1的受体菌。次日按1%的接种量将重组菌pGEX-6p-1-ORF3接种到新鲜的含Amp+的LB培养基中，37℃培养至OD600值约为0.6～0.8左右时，取1 mL作为未诱导样品，加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）至终浓度1 mmol/L，37℃诱导表达8 h，收集1 mL菌液，用120 g/L分离胶进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析。

将BL21转化菌进行诱导表达后，收获菌体进行超声波破碎，离心分离后分别取上清和沉淀进行SDS-PAGE电泳，检测目的蛋白的可溶性。

1.6 Western-blot鉴定

将SDS-PAGE凝胶的蛋白带电转移至硝酸纤维素膜，以封闭液（TBST+1%BSA）封闭过夜，与PCV2阳性猪多抗血清37℃温浴1 h，经充分洗涤后，再转入封闭液稀释的HRP标记羊抗猪IgG中，37℃温浴1 h，DAB显色。

2 结果与分析

2.1 ORF3的扩增及重组质粒鉴定

用P1/P2引物进行扩增，得到大小约为314 bp的片段（如图1）。大小与预期结果相符。将该片段与经双酶切作用后的原核载体pGEX-6p-1连接后，连接产物转化入大肠杆菌JM109感受态细胞，经BamH I+Sal I双酶切及PCR鉴定，出现约314 bp大小的片段（图2、图3）。经测序，结果表明所连序列即为目的序列。

图1 ORF3基因的PCR扩增

图2 重组质粒pGEX-6p-1-ORF3的PCR鉴定

图3 重组质粒pGEX-6p-1-ORF3的酶切鉴定

2.2 PCV2 pGEX-6p-1-ORF3的诱导表达、分析

通过SDS-PAGE电泳分析在E.coli中重组蛋白pGEX-6p-1-ORF3大小约为37 kD（pGEX-6p-1载体所带的GST标签大小为26 kD）（如图4），在37℃条件下表达的pGEX-6p-1-ORF3主要以包涵体形式存在。进一步调整诱导条件，降低诱导温度、IPTG浓度、延长诱导表达的时间，但仍是大部分以包涵体形式存在，对包涵体进行纯化，如图5所示。

图4 pGEX-6p-1-ORF3表达产物的SDS-PAGE检测

图5 pGEX-6p-1-ORF3表达产物可溶性鉴定和纯化

2.3 pGEX-6p-1-ORF3表达产物的Western blot鉴定

重组蛋白pGEX-6p-1-ORF3与抗PCV2的猪血清相互作用后，利用化学底物进行显色，可以观察到明显的特异性蛋白条带（图6），重组蛋白pGEX-6p-1-ORF3能够和PCV2阳性血清发生特异性相互作用，说明其与天然的ORF3蛋白一样，具有作为候选抗原应该具有两种特征之一，即反应原性。

图6 重组蛋白pGEX-6p-1-ORF3的Western blot检测

3 讨 论

ORF3蛋白是新发现的PCV2非结构蛋白，是近年来的研究热点。位于基因组互补链上，ORF1基因的内部，方向与ORF1基因相反[6]。Liu等采用点突变技术使PCV2 ORF3基因功能缺失，并用缺失ORF3功能的PCV2进行 PK-15细胞的感染试验以验证ORF3的功能，表明ORF3编码蛋白是在病毒复制中属非必需的蛋白，它是通过诱导细胞凋亡从而在致病性方面发挥作用。其他试验也表明，ORF3编码蛋白与 PCV2的致病性也有一定的关系，由ORF3编码的蛋白可以影响病毒衣壳蛋白在机体内的免疫效果[9]。ORF3蛋白的缺失或变异均能减弱PCV2的致病。

研究成功构建了重组质粒pGEX-6p-1-ORF3，并在大肠杆菌中诱导表达，但重组蛋白以包涵体的形式存在，需要变性、浓缩并复性。为此，本研究用Ni2N TA蛋白纯化试剂盒（QIA GEN公司），对目的蛋白进行了纯化、浓缩，浓缩后的蛋白浓度可达6.11 mg/mL，该质量浓度完全能满足后续试验需要。为了恢复重组蛋白的免疫学活性，研究利用蛋白复性试剂盒proteinrefolding kit（Novagen公司）对其进行透析复性，Western blot检测结果表明，经纯化复性的重组蛋白能够特异性的结合PCV2多克隆抗体，表明目的蛋白具有与PCV2相同的抗原性，可用于PCV2 ORF3单克隆抗体及PCV2的ELISA检测方法研究。试验通过PCR扩增得到了ORF3基因，并将其连接到了表达载体pGEX-6p-1上，得到了阳性表达质粒pGEX-6p-1-ORF3，将其转化入大肠杆菌BL21（DE3）中，但未获大量融合表达，重组蛋白以包涵体形式存在，免疫印记试验均证实重组表达蛋白具有良好的反应原性，命名为pGEX-6p-1-ORF3，为进一步研究ORF3蛋白的生物活性、功能及对PCV2致病机理的影响奠定了基础。

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