海参肠高效酶解工艺研究

李冬燕 ，曹 荣 ，刘 淇 ，陈海华 ，殷邦忠

（1.青岛农业大学食品科学与工程学院，山东 青岛 266109；2.中国水产科学研究院黄海水产研究所，山东 青岛 266071）

海参是中国传统的滋补珍品，具有延缓衰老、防治肿瘤等多种功效[1]。近年来，中国海参产业发展迅速，市场规模不断扩大。然而，中国海参加工的技术水平和综合利用程度还较低，加工过程中的下脚料（如海参肠、性腺等）尚未得到充分的开发利用。

酶解反应具有反应效率高、反应条件温和、对氨基酸破坏小等优点[2]。蛋白质经酶解后其功能特性得到改善，具有更好的溶解性、乳化性、流变性等加工性能[3]。随着酶技术的发展，酶法水解在水产加工下脚料综合利用中的应用越来越广泛[4]。笔者以海参肠为原料，对其水解用蛋白酶进行了筛选，在单因素分析基础上，通过正交试验对海参肠酶解的工艺条件进行了优化，以期为提高海参的综合利用率，开发海参功能食品提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试材料 海参肠，由大连棒棰岛海产企业集团有限公司提供。

1.1.2 试剂与仪器 试剂：中性蛋白酶（1.3×105U/g）、木瓜蛋白酶（5.0×105U/g）、菠萝蛋白酶（5.0×105U/g），均由吉宝（青岛）生物科技有限公司提供。其他试剂均为国产分析纯。仪器：SHA-B型恒温振荡水浴锅（常州国华电器有限公司）；Centrifuge 5804R型冷冻离心机（上海富众生物科学有限公司）；UV-2800型紫外可见分光光度计（尤尼克柯仪器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 水解度的测定 采用三氯乙酸（TCA）沉淀法[5]。取5.0 mL酶解液加入等体积的TCA溶液（质量分数 15%，w/v），静置 20 min后，10 000 r/min离心10 min。取上清液，采用双缩脲比色法测可溶性蛋白含量。总蛋白含量的测定采用微量凯氏定氮法[6]。

按照如下公式进行水解度的计算：DH（%）=（N2-N1）/（N0-N1）×100

式中：DH（degree of hydrolysis）为水解度；N2为酶解液中15%TCA可溶性蛋白含量（mg）；N1为水解前海参肠匀浆液中15%TCA可溶性蛋白含量（mg）；N0为海参肠中总蛋白含量（mg）。

1.2.2 海参肠水解用酶的筛选 取海参肠加定量超纯水后匀浆。匀浆液分别添加中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶及其复合物，在各自适宜条件下，进行水解试验，根据水解度进行单酶的筛选，并确定双酶复合的种类及其配比。

1.2.3 单因素试验分析 在确定试验用酶的基础上，进行底物质量分数、酶用量、水解时间等单因素试验，考察各因素对水解度的影响。

1.2.4 正交试验设计 在1.2.3单因素试验分析基础上，采用三因素、三水平L9（34），进行正交试验（表1），并进行方差分析，根据分析结果得到酶解海参肠的最佳工艺。

表1 正交试验设计因素和水平

1.2.5 数据处理 试验重复2次，每组试验设3个平行，结果以平均值±标准偏差表示，应用SPSS 11.0统计处理软件进行统计分析，显著性界值以p<0.01为极显著，p<0.05为显著，p>0.05为不显著。

2 结果与分析

2.1 不同蛋白酶水解海参肠的效果比较

中性蛋白酶、菠萝蛋白酶和木瓜蛋白酶是水产动物蛋白水解的常用酶。研究选取这3种蛋白酶，添加量为2 000 U/g原料，底物质量分数为10%，分别在其各自最适条件下进行水解。从图1可以看出，3种蛋白酶的水解曲线有所不同，中性蛋白酶和木瓜蛋白酶对应的水解度基本是在3 h时达到最大，菠萝蛋白酶对应的水解度在2 h时达到最大，水解度都是在开始阶段迅速增加，之后增速变缓。其中，中性蛋白酶对应的水解度最高，为29.66%。

图1 不同蛋白酶对海参肠的水解曲线

2.2 单酶复合对海参肠水解度的影响

在单酶试验的基础上，对3种蛋白酶两两复合，按照总酶量2 000 U/g原料、酶活比1∶1添加，底物质量分数10%，水解时间3 h。结果表明：中性蛋白酶+木瓜蛋白酶、中性蛋白酶+菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶+菠萝蛋白酶的水解度分别为34.56%、32.11%、29.16%。双酶对应的水解度要明显高于单酶水解（p<0.05），中性蛋白酶与木瓜蛋白酶复合时水解度最大（34.56%），因此后续试验选择中性蛋白酶加木瓜蛋白酶进行复配。

2.3 复合酶中单酶配比对水解度的影响

按照中性蛋白酶与木瓜蛋白酶不同酶活比（总酶量2 000 U/g原料）、水解时间3 h、底物质量分数10%进行水解试验。结果表明：当中性蛋白酶与木瓜蛋白酶酶活比为 1∶1、1∶1.5、1∶2、1.5∶1、2∶1 时，水解度分别为34.56%、37.73%、37.50%、40.93%、36.52%。虽然总的酶量相同，但不同的配比对应的水解度差别很大，中性蛋白酶与木瓜蛋白酶酶活比为1.5∶1时对应的水解度最大（40.93%），因此后续试验中均采用中性蛋白酶与木瓜蛋白酶1.5∶1的配比。

2.4 海参肠复合酶解单因素试验分析

采用中性蛋白酶和木瓜蛋白酶按照酶活比1.5∶1进行复配，进行海参肠水解的单因素试验分析，结果见图2。结果表明，随底物质量分数的提高，海参肠的水解度先增大后减小，在底物质量分数5%左右达到最大；水解度随酶量增加而增大，至酶量2 000 U/g原料时基本达到最大；在最初的1.5 h内水解度迅速升高，之后趋于平稳。

图2 底物质量分数

2.5 正交试验结果及分析

海参肠复合酶解的正交试验结果如表2所示，从极差值R可以得出，RA>RB>RC，说明影响水解度的因素依次为底物质量分数>加酶量>水解时间；从表3的方差分析结果可以看出，底物质量分数和加酶量对水解度的影响显著；水解时间在选定的水平范围内影响不显著。其较优组合为A2B3C1，即底物质量分数8%，加酶量3 000 U/g原料，水解时间2.5 h，在此条件下水解度可达到55.76%。

表2 正交试验L9（34）结果

表3 正交试验方差分析结果

3 讨论与结论

笔者以海参肠为对象，采用蛋白酶水解的方式，以水解度为指标，通过正交试验得到海参肠的最佳酶解工艺。研究结果显示，双酶水解的水解度要明显高于单酶水解，这可能与酶的特异性有关。两种酶的酶活比对水解度也有影响，该研究选取中性蛋白酶∶木瓜蛋白酶=1.5∶1，在此条件下得到的水解度最大。通过正交试验可以看出，双酶复合水解海参肠的水解度受底物浓度、加酶量、水解时间等因素的影响，底物浓度和加酶量对水解度的影响显著，水解时间在选定的水平范围内影响不显著。正交试验最优组合为底物质量分数8%，加酶量3 000 U/g原料，水解时间2.5 h，在此条件下水解度可达到55.76%。

水产动物蛋白水解多采用中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、风味蛋白酶等，或采用多种酶的复合物。实际生产中，酶的选择应考虑水解效果、成本等多个因素。利用酶技术加工海参肠可以有效降低蛋白质分子量，增加多肽和氨基酸含量，最大限度保留海参肠的营养成分。笔者采用中性蛋白酶与木瓜蛋白酶复合进行海参肠的酶解，2.5 h内水解度可达到55.76%，有效地缩短了水解时间，简化了生产工艺，降低了生产成本，为海参下脚料高值化利用提供了科学依据。

[1]张春云，王印庚，荣小军，等.国内外海参自然资源、养殖状况存在问题[J].海洋水产研究，2004，6（3）：89-90.

[2]周远扬，雷百战，潘 艺.酶技术在水产品加工下脚料利用方面的应用[J].广东农业科学，2008，（7）：107-108.

[3]苑艳辉.水产品下脚料综合利用研究之进展 [J].水产科技情报，2004，31（1）：44-48.

[4]Kuo C H.Purification of antioxidative peptides prepared from enzymatic hydrolysates of tuna dark muscle by-product[J].Food Chemistry，2010，122：42-48.

[5]檀志芬，生庆海.蛋白质水解度的测定方法 [J].分析检测，2005，26（7）：175.

[6]无锡轻工业学院，天津轻工业学院.食品分析[M].北京：中国轻工业出版社，1996.