重组可逆转水蛭素制备及活性测定

黄 程，李红亮，冯一建，陈 勇，陈海容，王 林，范 开，

(1.重庆理工大学药学与生物工程学院重庆 400054;2.重庆富进生物医药有限公司 ，重庆 400041)

水蛭素(Hirudin)是医用水蛭(Hirudo medicinals)的唾液腺分泌的一种活性多肽，是目前已知的自然界中最强的抗凝血因子。水蛭素与凝血酶亲和力极高，能以摩尔比1∶1结合形成非共价复合物［1］。水蛭素与凝血酶结合后，使凝血酶失去裂解纤维蛋白原为纤维蛋白的能力，并阻止纤维蛋白的凝固和凝血酶催化的止血反应以及凝血酶诱导的血小板反应，达到抗凝目的［2］。重组水蛭素与凝血酶结合后具有不可逆转性。临床研究表明，重组水蛭素在治疗HIT(肝素介导的血小板减小症)病人时，出血率为 18.8% ～20.4%［3］，在进行预防全髋关节置换术时，深静脉血栓的出血率为17.0%。该出血副作用限制了重组水蛭素在临床上的广泛应用［4］。

比伐卢定(Bivalirudin)是通过化学合成的含20个氨基酸的水蛭素衍生物，是直接的、特异的、可逆性的凝血酶抑制剂。临床结果表明，比伐卢定几乎无出血风险。比伐卢定C端12个氨基酸为凝血酶识别结合位点，N端的D-Phe-Pro-Arg-Pro-(Gly)4区域是与凝血酶活性区相互作用的位点，二者与游离型或与结合型凝血酶催化位点和底物识别位点发生特异性结合，从而直接抑制凝血酶的活性［5］。因凝血酶可水解比伐卢定Arg3和Pro4之间的肽键，使其失去抗凝活性，所以比伐卢定对凝血酶的抑制作用可逆而短暂［6］。

水蛭素分子如蝌蚪状，由2个结构区域组成:头部N端为球状致密结构，它与凝血酶的活性位点结合，抑制其催化活力;尾部C端主要为带负电的羧基末端，与凝血酶的阴离子结合外侧位点(即纤维蛋白原识别位点，FRE)结合，抑制凝血酶与纤维蛋白原的相互作用。水蛭素分子头部和尾部之间存在一个指状结构从复合物中部突出，不与凝血接触，属功能非必需区，不参与凝血酶的抑制作用［7－9］。

由于N端引入了D-Phe-Pro-Arg-Pro的结构，因此比伐卢定具有可逆转性。D-Phe-Pro-Arg-Pro的结构可被凝血水解，水解后比伐卢定丧失抗凝活性，从而使凝血酶活性恢复。本研究将水蛭素的指状区域第45位至第48位氨基酸Thr-Pro-Lys-Pro替换为 Phe-Pro-Arg-Pro，通过重组构建和表达，获得与比伐卢定类似的能够被凝血酶降解且保留原水蛭素活性的新型可逆转水蛭素(命名为G4-HV1)，避免了重组水蛭素在临床应用时的出血风险。

1 材料和方法

1.1 材料

质粒pPIC9和pPIC9K、大肠杆菌TOP10F’和毕赤酵母GS115，以及天然水蛭素(WT-HV1)均由重庆富进生物医药有限公司保存;比伐卢定(Bivalirudin)由成都凯捷生物医药科技发展有限公司提供;基因合成、测序及克隆所需的工具酶均购自于宝生物(大连)有限公司;冻干人凝血酶国家标准品购于中检所;Chromozyme TH(生色底物)购于Roche;Phenyl Sepharose 6 Fast Flow购于Amersham pharmacia biotech;C18 柱(XB-C18，5 μm，10 mm×150 mm)来自Welch Material;其他试剂均为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 重组质粒的构建

根据G4-HV1的cDNA序列，同时设计5’和3’端酶切位点为 Xho I和Not I，送由宝生物(大连)有限公司全基因合成，插入pMD-19T载体，命名为pMD-19T-G4-HV1。

用XhoⅠ和NotⅠ双酶切空白质粒pPIC9和pMD-19T-G4-HV1，回收双酶切空白质粒pPIC9后约8 000 bp片段，以及pMD-19T-G4-HV1约200 bp的片段。连接回收的2个片段转入TOP10F’，用LB+Amp平板筛选重组子，然后用SalⅠ和SacⅠ切下经鉴定的pPIC9-G4-HV1上约3 000 bp片段，插入经相同酶切的pPIC9K上，构建成重组质粒pPIC9K-G4-HV1，经酶切鉴定后送宝生物(大连)有限公司测序。

1.2.2 电转化酵母

将SacⅠ线性化测序正确的重组质粒pPIC9KG4-HV1进行浓缩，然后电转入宿主菌Pichia pastrois GS115，铺于MD(1.34%YNB，4 ×10-5%Biotin，2%Dextrose，1.5%Agar)平板，筛选阳性克隆。浓缩、电转及筛选具体操作方法见Invitrogen Multi-Copy Pichia Expression Kit操作手册。

1.2.3 高表达菌种筛选

由于pPIC9K载体带有Kanamycin抗性基因，能使阳性转化子产生Geneticin(G418)抗性，且抗性随整合到宿主菌上的外源基因的增加而增加［10］，因此选用1 ～5 g/L G418的YPD平板来进行筛选。挑取单菌落分别点于含不同浓度的G418 YPD平板，30℃培养箱培养3～5 d。随机挑取在不同浓度G418的YPD平板上长出的重组子菌落，接种于含100 Ml BMGY培养液的1 000 mL摇瓶中，30℃摇床培养16～20 h。至 A600为2～6时加入BMMY培养液100 mL，30℃继续培养24～96 h。每隔 24 h取样，并补入 0.5%甲醇。用SDS-PAGE监测G4-HV1表达情况。

1.2.4 纯化

摇床表达菌液经高速冷冻离心机离心后，收集上清液。按1 mol/L补入(NH4)2SO4，进行phenyl柱纯化。用不同浓度(NH4)2SO4进行洗脱。将洗脱后的样品通过Welch C-18柱进行反相纯化，流动相:A液为5%乙腈，95%水，0.1%TFA;B液为95%乙腈，5%水，0.1%TFA。经 0～40%，30 min梯度洗脱。流速为 2 mL/min，在波长280 nm下进行检测，以获得G4-HV1。

1.2.5 生物学活性测定

分别取:50 mM Tris-HCL、0.1%PEG6000、pH值为7.8的chromozym TH溶液，用稀释液溶解稀释chromozym TH为2 mM。用稀释液溶解稀释凝血酶为20 IU/ml制成凝血酶溶液。供试样品稀释至1 mg/mL。按 1∶400、1∶800、1∶1 600、1∶3 200、1∶6 400、1∶12 800 稀释，每个样品取样 50 μL 于96孔酶标板，每个梯度3个复孔，再分别加入50 μL凝血酶溶液，置37℃保温5 min。分别加入50 μL chromozym TH溶液，置37℃保温2 min。分别加入250 μL乙酸终止反应，再补加600μL蒸馏水，测定OD405值。以水蛭素含量为横坐标，OD值为纵坐标作一条线性直线，计算直线横坐标截距，即为一个抗凝单位水蛭素量。以此计算水蛭素比活性。

1.2.6 G4-HV1与凝血酶结合动力学

分别取 50 mM Tris-HCL，0.1%PEG6000，pH值为7.8的溶液配制成2.0 μg/mL 的BivalirudinWT-HV1 和 G4-HV1 各500 μL，与人凝血酶(20.0 IU/mL)500 μL 混合。37 ℃水浴作用 0、5、10、20、30、60 min后，取出置冰上。取每个稀释度50 μL样品于96孔酶标板中(复孔)，再分别加入50μL人凝血酶(20 IU/mL)，置37℃保温5 min。每孔再加入 50 μL chromozym TH 生色底物试剂(2 mM，Roche公司出品)，37℃反应2 min。每孔加入25 μL乙酸终止反应，405 nm测定OD值。

2 实验结果

2.1 重组质粒的构建

重组质粒pPIC9k-G4-HV1的酶切结果(图1)和宝生物(大连)有限公司序列测定结果表明，所构建的质粒的序列与设计的序列完全一致，因此成功构建了pPIC9k-G4-HV1表达质粒。由于质粒pPIC9k上有2个Xho I的酶切位点，所以需先将目的基因转入质粒pPIC9中，然后再经过Sac I和Sal I双酶切转入pPIC9k中。

图1 pPIC9k-G4-HV1质粒双酶切结果

2.2 重组转化子的表达

摇床表达菌液取1 mL离心，留上清用TCA法沉淀做电泳分析(图2)。电泳结果表明，成功表达出G4-HV1。挑取表达量相对较高的7号进行摇床培养表达。

图2 摇床表达结果

2.3 纯化

5 L表达菌液，离心收集上清，经疏水柱及反相C-18柱纯化。将获得的G4-HV1进行RPHPLC分析和质谱分析(LC/MSD SL质谱仪，Aglient Technologies公司出品)测定分子量，结果表明G4-HV1纯度可达95%以上(图3)。分子量测定结果与理论分子量一致。

图3 RP-HPLC分析制备样品结果

2.4 G4-HV1抗凝活性及可逆转性测定

1)G4-HV1抗凝活性的测定。取G4-HV1，按比例稀释，用TH法测定得到G4-HV1的抗凝活性约为14 000 ATU(图4)，WT-HV1的抗凝活性约为15 000 ATU(抗凝活性数据由重庆富进生物医药有限公司提供)。

图4 TH法测定G4-HV1的抗凝活性

2)G4-HV1与凝血酶结合动力学。如图5，经生色底物法测定后，比伐卢定100%可逆转(与文献报道相符)［11］，G4-HV1可逆转性为 30% ～40%，而天然水蛭素完全不可逆转。

图5 TH法测定G4-HV1与凝血酶结合动力学

3 讨论

经上游构建筛选、表达、纯化和质谱鉴定得到了纯度95%以上的G4-HV1，生色底物法测定G4-HV1的抗凝活性约为14 000 ATU，与凝血酶结合动力学表明G4-HV1的可逆转性为30%～40%。

G4-HV1的抗凝活性约为14 000 ATU，与水蛭素(约15 000 ATU)的活性基本无差异。本研究结果再次证明，水蛭素主要活性区域为N端球形区和C端纤维蛋白原结合区，指状区域对活性几无影响。但是将水蛭素的第45位至48位氨基酸替换为 Phe-Pro-Arg-Pro后，G4-HV1的可逆转性为30%～40%，未出现比伐卢定样100%可逆转性。初步推测可能有2个原因:①水蛭素N端是由40多个氨基酸组成的球状致密结构，使其与凝血酶结合更紧密，虽然中间的指状区域被替换，但是由于空间位阻的影响，凝血酶的酶切的效率较低，从而G4-HV1的可逆转只有30% ～40%;② 由于比伐卢定N端第1个氨基酸为D型，有研究［12］表明，比伐卢定N端的D型氨基酸有助其被凝血酶水解，而通过酵母表达的则为L型，所以G4-HV1的可逆转相对比伐卢定低。

本文所研究的G4-HV1可逆转性相对较低，下一步将通过分子模拟结合实验，将G4-HV1第41位至44位或第49位至52位的氨基酸改为柔性较强的甘氨酸，使指状区域暴露更充分，更利于凝血酶酶切，使可逆转水蛭素活性丧失更迅速，凝血酶活性恢复更快，进一步提高可逆转水蛭素的可逆转性。

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