米尔顿姬小蜂线粒体16S rRNA与COⅠ基因片段序列测定及分析

黄蓬英，林玲玲，洪钦阳，廖富荣厦门出入境检验检疫局，福建厦门3606;福建农林大学植物保护学院，福建福州35000

米尔顿姬小蜂 Anselmella miltoni Girault，属膜翅目Hymenoptera小蜂总科Chalcidoidea姬小蜂科Eulophidae Anselmella属，最早仅分布于澳大利亚，现已扩散至我国台湾地区。其幼虫以取食蒲桃属Syzygium的种子为生，严重影响水果的产量和食用价值(黄蓬英等，2008)。2007、2009年厦门检验检疫局对来自台湾的莲雾Eugenia javanica Lam实施检疫时发现该虫。目前，有关米尔顿姬小蜂的研究较少，尤对其生物学、种群遗传等特性缺乏深入的研究。

昆虫的线粒体基因(mtDNA)大小一般为15.4～16.3 kb。16S rRNA是mtDNA上进化速率中等的基因，其序列高度保守，常被用于高级分类阶元的系统进化和分类鉴定(黄华平等，2006;龙健和庞虹，2003;苏成勇等，2007)。线粒体细胞色素氧化酶第Ⅰ亚基(cytochrome oxidase subunitⅠ，COⅠ)是保守性中等的基因区段，目前已被广泛用于昆虫种间、尤其是种内的遗传变异研究(窦向梅等，2005)。以上述2个基因片段序列作为DNA条形码，已成为生物分类领域的研究热点。迄今为止，有关米尔顿姬小蜂线粒体16S rRNA和COⅠ基因序列尚未见报道。本研究通过PCR扩增，测定16S rRNA和COⅠ部分序列，并对其进行分析，以期为米尔顿姬小蜂的分子鉴定提供依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

试验所用虫样为厦门检验检疫局从台湾莲雾上截获的米尔顿姬小蜂成虫。标本浸泡在无水乙醇中，－70℃保存。取米尔顿姬小蜂成虫5头于双蒸水中漂洗，用吸水纸吸干备用。

1.2 主要生化试剂和仪器

基因组DNA提取试剂盒Universal Genomic DNA Extraction Kit、dNTP Mixture(2.5 mmol·L－1)购自TaKaRa宝生物工程(大连)有限公司;Dream TaqTMDNA Polymerase(5 U·μL－1)、10 × Dream TaqTMBuffer(含 20 mmol·L－1MgCl2)购自 Fermentas公司;100 bp DNA Ladder购自天根生化科技(北京)有限公司;PCR引物合成、克隆及测序委托上海生工生物工程公司完成;PCR仪为ABI公司的Applied Biosystems Thermal Cycler Veriti 96 Well。

1.3 总DNA的提取

基因组DNA提取参照试剂盒说明书(TaKaRa，Kit Ver.3.0)的方法。

1.4 PCR扩增及电泳

16S rRNA基因序列的PCR扩增引物参考Szalanski et al.(2008)，上 游 引 物 为 LR-J-13007(5'-TTACGCTGTTATCCCTAA-3')，下游引物为LR-N-13398(5'-CGCCTGTTTATCAAAAACAT-3');COⅠ基因序列的扩增引物参考Kolesik et al.(2009)，上游引物为COⅠs(5'-GGATCACCTGATATAGCATTCCC-3')，下游引物为COⅠa(5'-CCCGGTAAAATTAAAATATAAACTTC-3')。

PCR反应的总体积为50 μL，其中包括10×Dream TaqTMBuffer(含20 mmol·L－1MgCl2)5 μL，dNTP Mixture(2.5 mmol·L－1)4 μL，上、下游引物(10 μmol·L－1)各 2 μL，Dream TaqTMDNA Polymerase(5 U·μL－1)0.25 μL，模板 DNA 4 μL，加灭菌双蒸水至终体积。

PCR反应程序:95℃预变性3 min;94℃变性45 s，53℃退火1 min，72℃延伸1 min，35个循环;最后72℃延伸7 min。

1.5 克隆测序与序列分析

将PCR产物回收纯化后进行克隆及测序。将获得的DNA序列通过NCBI进行BLAST相似性检索，经人工核对后确认所得的序列片段，然后用DNAMAN和DNACLUB软件对序列进行剪裁与分析。

从GenBank上下载姬小蜂科的Chrysocharis nautilus(Walker)(GenBank登录号:HM573784)、C.eurynota Graham(GenBank登录号:HM573749)，蚜小蜂科的Encarsia berlesei(Howard)(GenBank登录号:GQ922199)，赤眼蜂科的Trichogramma nmwanzai Schulten(GenBank 登录号:DQ177920)、T.brasiliensis Ashmead(GenBank登录号:DQ177919)，金小蜂科的 Pteromalus sp.(GenBank登录号:HM574095)、NasonialongicornisDarling(GenBank登录号:GQ336371)的序列进行比较，并采用DNAMAN上的Maximum Likelihood方法绘制系统发育树。

2 结果与分析

2.1 米尔顿姬小蜂16S rRNA和COⅠ PCR扩增

利用2对通用引物对米尔顿姬小蜂进行PCR扩增。引物LR-J-13007/LR-N-13398扩增到16S rRNA约420 bp的条带;引物COⅠs/COⅠa扩增到COⅠ基因约490 bp的条带(图1)。

2.2 序列分析

2.2.1 米尔顿姬小蜂16S rRNA序列分析 克隆测序结果表明，米尔顿姬小蜂16S rRNA基因序列为426 bp(图2)。同源性比较发现，该序列与数据库中部分物种的序列有很高的同源性，因而确定克隆片段为16S rRNA基因部分序列。A、T、C、G平均含量分别为 175 bp(41.10%)、182 bp(42.70%)、39 bp(9.20%)、30 bp(7.00%)，且 A+T 含量(83.80%)大于 G+C 含量(16.20%)。

图1 米尔顿姬小蜂16S rRNA和COⅠ基因的PCR扩增产物Fig.1 PCR amplification products of 16S rRNA and COⅠgenes in A.miltoni

2.2.2 米尔顿姬小蜂COⅠ序列分析 克隆测序结果表明，米尔顿姬小蜂 COⅠ基因序列为488 bp(图3)。同源性比较发现，该序列与数据库中部分物种的序列有很高的同源性，因而确定克隆片段为COⅠ基因部分序列。A、T、C、G平均含量分别为144 bp(29.51%)、211 bp(43.24%)、70 bp(14.34%)、63 bp(12.91%)，且 A+T 含量(72.75%)大于 G+C 含量(27.25%)。

2.2.3 基于COⅠ部分序列构建的系统发育树 根据COⅠ部分序列，利用DNAMAN的Maximum Likelihood方法构建的系统发育树如图4。米尔顿姬小蜂与蚜小蜂科的E.berlesei亲缘关系最近，与姬小蜂科的C.nautius、C.eurynota亲缘关系较远。而按照形态学分类，米尔顿姬小蜂应与后者亲缘关系较近。这可能与米尔顿姬小蜂是植食性小蜂，而其他种类是寄生蜂有关。

图2 米尔顿姬小蜂16S rRNA基因部分序列Fig.2 16S rRNA partial sequences in A.miltoni

图3 米尔顿姬小蜂COⅠ基因部分序列Fig.3 COⅠ partial sequences in A.miltoni

3 结论与讨论

本研究测定了米尔顿姬小蜂线粒体16S rRNA和COⅠ基因的部分序列，并分析了相应序列的碱基组成特征。结果表明，其16S rRNA和COⅠ基因的A+T含量分别为83.80%和72.75%，均明显高于C+G含量。该结果与其他昆虫的16S rRNA和COⅠ基因研究结果(谭宏伟等，2009;赵惠玲等，2010;郑福山等，2007)相符，即存在较强的A+T偏好性，这与昆虫线粒体基因的碱基组成特征基本一致。

根据COⅠ部分序列构建的系统发育树表明，米尔顿姬小蜂与蚜小蜂科的E.berlesei亲缘关系最近，与姬小蜂科的 C.nautius、C.eurynota 亲缘关系较远。

本研究获得了米尔顿姬小蜂线粒体16S rDNA和COⅠ基因的部分序列，为今后米尔顿姬小蜂的分子鉴定及系统发育研究等奠定了基础。基于COⅠ基因的条码技术已广泛应用于昆虫的分子鉴定，因此，设计米尔顿姬小蜂特异引物进行分子鉴定是下一步的工作重点。此外，米尔顿姬小蜂已入侵我国台湾地区，随着台湾水果进口量的不断增多，我国大陆也存在米尔顿姬小蜂大量入侵的风险，因此应引起有关部门的高度重视。

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黄华平，杨腊英，王国芬.2006.rDNA和mtDNA在昆虫系统发育与区系研究中的应用.华南热带农业大学学报，12(4):45－49.

黄蓬英，林玲玲，叶正青，徐梅，吴媛.2008.台湾莲雾上截获的米尔顿姬小蜂.植物检疫，22(3):178－179.

龙健，庞虹.2003.瓢虫的16S rDNA序列扩增.贵州师范大学学报:自然科学版，21(2):52－54.

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