桦褐孔菌粗多糖的精制方法探讨

韩耀玲，徐腾飞，贾中祥，杨春鹏，刘 洋，史顺水，韩 光

（河南大学药学院 天然药物化学教研室，河南 开封 475004）

桦褐孔菌（Inonotus obliquus）为多孔菌科的药用真菌，在我国的黑龙江、吉林两省资源较为丰富，民间广泛用于治疗一些恶性肿瘤［1］。对于桦褐孔菌的化学成分及生物活性研究已证实其具有抗肿瘤、抗炎、抗病毒、降血糖、降血脂及保肝等广泛的药理作用［2-13］。已有的报道多集中于羊毛脂烷型四环三萜类等小分子次生代谢产物的分离及相应的生物活性研究，并取得显著的研究成果，发现不少活性化合物。桦褐孔菌原药材中总三萜（醇提物）约占4.5%，较之多糖（最高可达14.1%）而言尚为少量［14］，而含量颇丰的多糖在桦褐孔菌的药效发挥中是否具有重要作用也是意义重大的研究，故近年陆续出现了桦褐孔菌粗多糖抗氧化、抗肿瘤、降血脂等药理作用的相关报道［15-17］。

对于粗多糖的提取多为传统的水提醇沉法，所得多糖产物中多含蛋白质、色素、无机离子等杂质，而其中蛋白质对于多糖的结构和活性研究的干扰是最大的，故对粗多糖的除蛋白效果就显得尤为重要，在此前提下，我们以多糖保留率和蛋白去除率为双重指标，对Sevag法、三氯乙酸法和酶法等常用的除蛋白方法进行了研究评价。

1 仪器与试剂

RE52－05旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；UV－1600型分光光度计（北京瑞利分析仪器公司）；电子天平（上海精科实业有限公司）；胃蛋白酶（1∶10000）；考马斯亮蓝为生化试剂；硫酸、蒽酮、氯仿、正丁醇和三氯乙酸均为分析纯。

2 实验方法

2.1 粗多糖的提取

取桦褐孔菌干燥子实体1kg，粉碎，体积分数95%的乙醇回流提取3次，1h／次，取药渣，加10倍量的水，沸水提取3次，提取时间分别为60、40、30min，将提取液合并后减压浓缩至2L，缓缓加入无水乙醇至含醇量为75%，静置过夜，抽滤，并将沉淀依次用无水乙醇、丙酮和乙醚洗涤，真空干燥10h，得桦褐孔菌粗多糖81g；将粗多糖配制成体积分数1%的水溶液，并依次用Sevag法、三氯乙酸法和酶法进行除蛋白处理，并对其精制效果进行比较和评价。

2.2 粗多糖的精制（除蛋白）

Sevag法：将氯仿与正丁醇4∶1混合，配成Sevag试剂，加入多糖水溶液（多糖水溶液／Sevag试剂为4∶1），剧烈振摇20min，2000r／min离心10min，分取水层（上层）；将水层如此反复除蛋白6次，即得Sevag法除蛋白的多糖水溶液。

三氯乙酸法：将三氯乙酸加水配制成0.5mol／L，加入多糖水溶液（多糖水溶液／三氯乙酸溶液为20∶3），剧烈振摇20min，静置40min，2000r／min离心10min，取上清液即得三氯乙酸法除蛋白的多糖水溶液。

酶法：将胃蛋白酶加入多糖水溶液，加入量为1∶200（mL∶U），30℃水浴，酶解2h，沸水浴5min，对酶进行灭活，冷却至室温，2000r／min离心10min，取上清液即得酶法除蛋白的多糖水溶液。

2.3 测定多糖与蛋白的含量

测定溶液的配制：精密称取蒽酮100mg，溶解于体积分数80%硫酸溶液100mL中，配制成硫酸－蒽酮溶液；精密称取考马斯亮蓝G－250100mg，分别加入体积分数95%乙醇50mL和体积分数85%磷酸100mL溶解，最后用蒸馏水定容至1000mL，配制成考马斯亮蓝溶液。

硫酸－蒽酮法测定多糖：取粗多糖水溶液和除蛋白的多糖水溶液加10倍量的水进行稀释，取2mL，加入硫酸－蒽酮溶液6mL，混匀，沸水浴15min，冰浴15min，于625nm处测定其吸光度。

考马斯亮蓝法测定蛋白：取粗多糖水溶液和除蛋白的多糖水溶液加10倍量的水进行稀释，取1mL，加入考马斯亮蓝溶液5mL，混匀，放置10min，于595nm处测定其吸光度。

3 结果与讨论

按照“2.3”操作方法分别将Sevag法、三氯乙酸法和酶法除蛋白后的多糖水溶液进行多糖与蛋白的含量测定，重复实验6次。测定结果表明，Sevag法的多糖保留率较高（72.9%），多糖损失较小，但蛋白去除率最低（9.5%），对粗多糖的精制效果不佳；三氯乙酸法一次性可除去96.0%的蛋白质杂质，精制效果较好，但多糖保留率仅为13.3%，损失严重；酶法的多糖保留率为46.9%，蛋白去除率为43.8%，见表1、图1。

实验结果表明，对于桦褐孔菌多糖而言，Sevag法、三氯乙酸法和酶法均不能同时保持较高的多糖保留率和蛋白去除率，故均不是最佳的除蛋白方法。经综合分析，Sevag法的多糖保留率较高，多糖损失较小，而三氯乙酸法则具有最高的蛋白去除率，故在实际操作中可考虑将Sevag法和三氯乙酸法结合起来应用，以同时保持较高的多糖保留率和蛋白去除率，达到较好的精制效果。

表1 Sevag法、三氯乙酸法和酶法的除蛋白结果比较

图1 粗多糖溶液与3种方法除蛋白后水溶液多糖和蛋白测定结果图

有文献［18］报道，桦褐孔菌胞外多糖最佳的脱蛋白工艺为三氯乙酸法，其蛋白质去除率为68.5%，多糖损失率仅为2.45%。桦褐孔菌胞外多糖乃菌丝体培养液中存在的多糖，而培养液又为水溶液，与桦褐孔菌细胞内的环境有所不同，可能会使其多糖结构有所相同。我们实验结果与文献报道的桦褐孔菌胞外多糖的脱蛋白工艺结果不符，也进一步说明桦褐孔菌多糖与人工培养的菌丝体胞外多糖的结构中载蛋白情况可能不同，其药理作用也可能不尽相同（因结构决定活性），而这些均有待于进一步的实验研究。

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