拉莫三嗪和乙琥胺对颞叶癫痫的神经可塑性实验研究1）

王 琼，孙美珍，陈彦军

颞叶癫痫为成年难治性癫痫的主要类型，氯化锂－匹罗卡品诱导的颞叶癫痫模型成功的复制了人类复杂部分性发作，通过注射匹罗卡品诱导癫痫持续状态（status epilepticus，SE）形成，15d后大鼠出现自发性癫痫反复发作（spontaneous recurrent epileptic seizure，SRS）现象，这是一个成熟的慢性癫痫模型［1］。拉莫三嗪（lamotrigine，LTG）现已广泛用于难治性癫痫的治疗，但在此模型上的实验研究目前尚无相关文献报道。乙琥胺（ethosuximide，ESX）是失神性癫痫的首选用药，Leite等［2］在此模型上使用ESX，发现ESX不能减少慢性期大鼠自发性癫痫反复发作的次数，但并没有进一步观察脑电图和病理学变化。本实验通过行为学、脑电图、病理学等方面来评价LTG和ESX对该模型的作用，进一步为LTG的临床治疗提供理论依据，并探索ESX对此模型的脑电影响和神经可塑性改变。

1 材料与方法

1.1 实验动物 成年雌性SD大鼠50只，体重180g～220g，由山西医科大学动物中心提供，实验动物均以标准饲料喂养，自由摄食饮水，自然光照射，换气扇通风。

1.2 慢性癫痫模型制备 成年雌性SD大鼠，氯化锂3mmol／kg腹腔注射，18h～24h后首剂腹腔注射匹罗卡品30mg／kg，30 min后如无Ⅳ级以上发作，可每隔15min注射10mg／kg追加剂量，直至出现Ⅳ级以上无明显间歇的SE。实验动物痫性发作分级评价标准采用Racine（1972年）分级标准［3］选取发作级别为Ⅳ级或Ⅳ级以上者，SE持续60min后注射地西泮10mg／kg终止发作，终止发作后存活者视为造模成功。造模后大鼠于15 d后会出现自发性癫痫反复发作（spontaneous recurrent epileptic seizure，SRS）。

1.3 实验分组 随机分为模型组、正常对照组、LTG低剂量组、LTG高剂量组、ESX低剂量组、ESX高剂量组6组。模型组：使用氯化锂－匹罗卡品按上述方法进行造模，造模后无药物干预；正常对照组：以相同体积的0.9%氯化钠取代氯化锂、匹罗卡品、地西泮腹腔注射，无药物干预；LTG低剂量组：造模后24h以内给予拉莫三嗪10mg／kg灌胃，每天2次，连续7d给药；LTG高剂量组：造模后24h以内给予拉莫三嗪20mg／kg，每天2次；ESX低剂量组：造模后24h以内给予乙琥胺25mg／kg腹腔注射，每天2次，连续7d给药；ESX高剂量组：造模后24h以内给予乙琥胺50mg／kg，每天2次。

1.4 方法

1.4.1 行为学观察 采用视屏监测大鼠24h活动，记录大鼠出现SRS后4周的癫痫发作情况（发作强度和发作次数）。

1.4.2 脑电图采集 分别记录致痫后30d的脑电图，将大鼠用25%乌拉坦麻醉，使其处于半清醒状态，固定于脑立体定位仪上，定位在海马（矢状缝旁2mm，冠状缝后4mm，骨膜下5 mm），用BL－420F型电生理信号采集仪描记脑电活动。记录尖波，棘波，尖、棘慢复合波等痫性波的频率及波幅。

1.4.3 Timm组织化学染色 SE后30d，10%水合氯醛麻醉大鼠，经左心室分别迅速灌注生理盐水100mL、0.4%硫化钠缓冲液150mL、4%多聚甲醛400mL，之后断头取脑，以4%多聚甲醛固定4h～6h，30%蔗糖4℃浸泡过夜，行恒温冷冻冠状切片，切片厚度30μm，贴附于载玻片上。每只大鼠隔5张脑片取一张组成一套，每套切片8张～10张，共8套片子。行Timm组织化学染色方法。暗室中将切片浸入新鲜配制Timm孵育液［50%阿拉伯胶60mL、枸橼酸缓冲液（25.5%柠檬酸＋23.5%枸椽酸钠］10mL、5.7%对苯二酚溶液30mL和17%硝酸银2 mL），置于室温下避光染色45min～60min，蒸馏水洗净，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，置光学显微镜下观察。光镜下行齿状回内分子层timm银染苔藓纤维发芽MFS评分［4］。评分标准0分：未见出芽；1分：偶可见点状出芽；2分：可见点状或稀疏状出芽；3分：可见片状出芽；4分：可见高浓度的片状出芽；5分：可见连续致密浓度片状出芽。

1.5 统计学处理 所有数据用均数±标准差（x±s）表示，用SPSS13.0统计软件进行单因素方差分析及LSD组间比较。

2 结 果

2.1 行为学观察 注射匹罗卡品后大鼠均于5min内出现外周胆碱能反应（M样作用），如瞳孔缩小、竖毛、血泪、流涎、腹泻。5min～15min后出现Ⅰ级、Ⅱ级发作。17min～37min后出现SE的大鼠均发展为Ⅳ级、Ⅴ级连续发作。50只大鼠，4只为正常对照组，其余均造模，诱发SE并达Ⅳ级及以上的40只，造模成功率为87%。存活鼠进入2d～4d的毒性阶段，表现为蜷伏不动，不思饮食，极易激惹。此后行为渐趋正常。经过静默期后（SE后15d），可观察大鼠出现Ⅰ级～Ⅴ级自发性癫痫反复发作，最初多为局部性发作如前肢阵挛或面部抽搐，很快发展至全身强直性惊厥发作，一般持续时间不超过1min，发作均可自行终止。统计自SRS出现后1个月的发作次数（见表1）。正常对照组大鼠无惊厥发作，匹罗卡品诱导大鼠SE后，慢性期均可见大鼠有不同程度的惊厥发作，而经过拉莫三嗪的干预后，低、高剂量组均不同程度的抑制了癫痫的发作次数，并且以高剂量组更为明显。乙琥胺用药后，与模型组大鼠比较，25%的大鼠较明显地减少自发性癫痫的发作次数，38%的大鼠发作次数减少不明显，31%的大鼠发作次数明显增加。通过统计，ESX各组与模型组相比无统计学意义，并且高、低剂量组间也无统计学意义。

表1 各组大鼠每周每只大鼠SRS平均发作次数（x±s）

2.2 脑电图观察 正常对照组大鼠EEG以5Hz～10Hz的低波幅α、β波为主，波幅以50μV～100μV为主。慢性期模型组大鼠EEG表现为背景节律增快，阵发性尖棘波、多棘波、多尖波发放，波幅均大于200μV；LTG低、高剂量干预后脑电图均有改善，节律减慢，棘波、尖波减少，波幅降低，且以高剂量组改善明显；ETX低、高剂量干预组和模型组脑电图无明显差别，仍节律性出现尖波、棘波，频率快，波幅高。

2.3 苔藓纤维发芽（见表2） 海马齿状回颗粒细胞苔藓纤维终末富含Zn＋，硫化银对Zn＋特异性染色呈棕黄或黑色颗粒。正常对照组大鼠齿状回及CA3区齿状颗粒细胞轴突分布区有密集浓染的黑色颗粒，极少见到有苔藓纤维穿越齿状回颗粒细胞层到齿状回内分子层及CA3区椎体细胞始层；模型组可观察到有较多的苔藓纤维穿过颗粒细胞进入内分子层和CA3区，表现为片状出芽；LTG低、高剂量组Timm染色可见点状或稀疏状出芽；ESX低、高剂量组齿状回和CA3区同样可见片状出芽。通过对各组大鼠齿状回和CA3区MFS评分统计得出：LTG高、低剂量组与模型比较差异有统计学意义，LTG低、高剂量组间比较差异有统计学意义。LTG各组均可抑制齿状回和CA3区苔藓纤维发芽，且以高剂量组效果显著；ESX高、低剂量组与模型组比较无统计学意义，ESX低、高剂量组间比较无统计学意义。ESX各组不能抑制苔藓纤维向齿状回和CA3区发芽。

表2 各组大鼠MFS染色评分（x±s） 分

3 讨 论

通过本实验得出，LTG可以抑制慢性期自发性癫痫反复发作，改善脑电图的表现。Jari Nissinen［5］在杏仁核点燃诱发的颞叶癫痫的研究中发现，LTG可以减少84%的自发性癫痫，发作次数减少多于50%的占88%。但在匹罗卡品诱导的颞叶癫痫上，目前尚无相关文献报道。本研究发现LTG低、高剂量组均能减少慢性期自发性癫痫的反复发作，可以抑制癫痫的发生，尤以高剂量组效果显著。LTG可以有效地改善慢性期癫痫大鼠的脑电图，减少痫性波的频率，降低痫性波的波幅，与行为学观察结果一致。LTG的抗癫痫机制包括抑制电压依赖性钠通道，稳定细胞膜防止异常放电，抑制突触前膜谷氨酸盐释放等［6］。在此模型中Remy等［7］研究发现，与模型组相比，LTG可以阻断64%钠离子通道开放，从而抑制异常放电，减少痫性发作。Leite等［2］在此模型上使用ESX，发现ESX不能减少慢性期大鼠自发性癫痫反复发作的次数，对此模型无效，本实验的结论与上述一致。Jari等［5］刺激杏仁核诱发颞叶癫痫的模型里，ESX减少大鼠自发性癫痫大于50%的占38%，剩余的大鼠发作次数减少不明显或增加发作次数，这与本实验的观察结果相似。ESX干预后慢性期脑电图与无药物干预的癫痫大鼠相比无明显改善，同样符合行为学观察结果。ESX的药理作用与抑制T型Ca2＋通道有关，ESX可以抑制丘脑细胞低阈值T型Ca2＋电流，从而阻断丘脑3Hz／s的异常放电，而丘脑神经元T型Ca2＋电流是形成失神发作3Hz／s的棘慢复合波的基础结合本实验与以往的研究发现ESX对颞叶癫痫的发生无预防作用，推测ESX可能对颞叶的异常放电不起作用。

业已证实，海马损伤是癫痫发生的结果，又是颞叶癫痫形成的原因。苔藓纤维发芽（mossy fiber sprouting，MFS）是一种常见的颞叶海马损伤的表现，MFS是一种神经再生现象，即海马齿状回颗粒细胞的轴突在齿状回内分子层，CA3区下椎体层的异常生长。多数学者认为是由门区及CA3区的神经元死亡所诱发的，神经元的兴奋性递质的释放、凋亡以及缺失可以诱发MFS和突触重构［8］。苔藓纤维为兴奋性氨基酸能神经纤维，MFS将抑制性环路变成兴奋性环路，增加了发作敏感性从而促进癫痫的形成，成为SRS的主要原因［9］。李国良等［10］发现匹罗卡品模型慢性期MFS随着时间的延长，出芽越显著，SE后30d最显著，以后出芽缓慢，SE后60d与30d相比无明显变化。本实验观察SE后30d的MFS变化，发现与模型组比较LTG低、高剂量组均能抑制苔藓纤维向门区及CA3区椎体细胞延伸，高剂量组作用显著。LTG抑制MFS机制尚不明确，在Smolders等［11］的电刺激诱发SE的实验中，通过微注射LTG的方法，观察发现LTG能影响海马中谷氨酸、GABA以及多巴胺的含量，从而减少慢性期SRS次数和抑制MFS，其干预机制较为复杂，推测可能与兴奋性与抑制性环路有关，并未明确。以往的实验中并没有ESX在病理学方面的进一步研究，通过我们的研究发现，ESX不能抑制苔藓纤维向齿状回和CA3区出芽。我们的实验从病理学的方面支持行为学和脑电图的表现，为以往的观点提供了更多的证据。

下一步我们的研究要从各期兴奋性与抑制性氨基酸递质水平变化与神经可塑性的关系着手，揭示LTG对各期每种递质的影响以及递质变化和MFS之间的关系。

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