人食管鳞癌EC9706细胞线粒体DNA中ND1基因突变的检测及意义

刘宗文，冯天平，赵景志，田薇薇，韩 娜，孙淼淼，娄 欣，胡爱侠

(1.郑州大学第二附属医院肿瘤科，河南 郑州 450014;2.郑州大学公共卫生学院，河南 郑州 450001;3.河南省肿瘤医院病理科，河南 郑州 450003;4.郑州市中心医院，河南 郑州 450052;5.商丘市中心医院，河南 商丘 476000)

人类线粒体DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)的全部核苷酸序列分析已由剑桥分子生物学研究所完成，人类mtDNA的核苷酸序列全长为16569 bp，呈双链闭环结构［1-2］。mtDNA分为非编码区(D-LOOP区)和编码区。mtDNA编码区含有37个编码基因，分别编码2个rRNA、22个tRNA和13个编码呼吸链复合物亚单位的蛋白质。mtDNA中ND1基因为线粒体编码的13个蛋白多肽中复合体I(NADH-CoQ还原酶)的亚基。线粒体参与细胞的代谢、凋亡、衰老以及肿瘤的发生等生理和病理的代谢过程［3-4］。研究［5］已经表明mtDNA的异常与人类多种肿瘤关系密切。通过对人食管鳞癌EC9706细胞mtDNA中ND1基因进行检测，了解mtDNA中ND1基因是否有突变，作者曾在以往的研究［6-8］中发现人食管鳞癌中mtDNA编码ND1基因拷贝数是增加的，如果使得mtDNA编码ND1基因的表达下调，就可能达到治疗目的，进而为食管癌的治疗提供了新的思路。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 人食管癌细胞系 人食管鳞癌EC9706细胞株由中国医学科学院国家分子肿瘤重点实验室馈赠。

1.1.2 主要试剂和仪器 胎牛血清(天津TBD公司);PCR扩增试剂盒(上海Sangon公司);mtDNA引物、线粒体提取试剂和mtDNA萃取试剂盒(上海杰美基因医药科技有限公司);尿嘧啶、丙酮酸(美国Sigma公司)。CO2恒温培养箱(德国GMBH公司);BCM-100A型生物洁净工作台(苏州安泰空气净化公司);高速低温离心机(德国Heraeus公司);DNA热循环扩增仪(德国Biometra公司)。

1.1.3 引物设计 mtDNA的ND1基因引物(3059～4015，956 bp)序列如下:上游引物(MAF):5’-TTACTCCTGCCATCATGACC-3’，下游引物 (MAR):5’-AGAATGATGGCTAGGGTGAC-3’，扩增片段长度为956 bp。上述引物由上海杰美基因医药科技有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 细胞的复苏及培养 从液氮中取出人食管鳞癌EC9706细胞冻存管，迅速放入37℃水浴1～2 min使之融化;吸取细胞悬液，加入适量培养基;1000 r·min-1离心5 min，弃上清，加入培养基，重复离心2次;用含体积分数10%胎牛血清的培养基适当稀释后，接种于培养瓶内，置于37℃、体积分数为5%CO2培养箱中培养，次日更换1次培养基。以后按常规进行培养。

1.2.2 人食管鳞癌EC9706细胞mtDNA中ND1基因测序 提取mtDNA的ND1基因，PCR扩增ND1基因，用mtDNA的ND1基因引物(3059～4015，956 bp)，得到PCR反应产物。经过纯化的PCR产物由上海基康生物技术有限公司进行测序。

2 结果

人食管鳞癌EC9706细胞mtDNA中ND1基因测序结果:经测序发现EC9706细胞中的3971处出现点突变，由C突变为T，其碱基序列和测序图见图1、2。

3 讨论

人类的mtDNA全部核苷酸序列分析测定已经完成。mtDNA存在于线粒体内膜上，是惟一的核外遗传物质。目前的研究［9］已经表明mtDNA的异常与人类多种肿瘤的关系密切。mtDNA分为非编码区(DLOOP区)和编码区。对于D-LOOP区的研究一直较热，但尚无定性结论。对于编码区的研究目前较少，对这些mtDNA突变或功能异常所发生的分子遗传机制的研究，可以阐明肿瘤的发病机制、mtDNA的表达情况、mtDNA与核DNA的相互作用及协调一致表达的机制，并为肿瘤的治疗提供理论指导［10］。

本实验对人食管鳞癌 EC9706细胞mtDNA中ND1基因进行测序，结果发现人食管鳞癌EC9706细胞mtDNA中ND1基因的3971处出现点突变，由C突变为T，这种突变可能是肿瘤发病的原因。

研究［11］显示，细胞凋亡与肿瘤的发生、发展及预后关系密切。由于mtDNA与体内能量代谢相关，所以mtDNA突变或功能异常容易导致能量合成减少，进而引发细胞衰老、死亡和凋亡，细胞发生凋亡或坏死受多种因素调控，其中mtDNA突变或功能异常或许就是诸多调控因素之一［12-16］。

根据上述研究成果，Uchida等［14］用莫法罗汀处理乳腺癌细胞系ZR-75-I和MCF-7，发现了mtDNA编码ND1基因的表达下调，提示化疗药物可能通过抑制mtDNA的转录水平达到抑制肿瘤细胞增殖的目的。本研究与上述诸多学者思路和结果一致，mtDNA的突变或功能异常可促进细胞凋亡从而达到抑制细胞增殖的目的，这为食管癌的治疗提供了新的思路，有可能通过特异性降低肿瘤细胞的mtDNA来治疗肿瘤。另外，肿瘤细胞线粒体膜极性增加，肿瘤细胞mtDNA可能成为亲脂性阳离子化疗药物的选择性作用部位。这些研究将使食管癌的治疗出现新的希望。

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