叶损伤对兴安落叶松防御酶活性的系统诱导1)

王 琪 严善春 金 虎 王艳军

(林木遗传育种国家重点实验室(东北林业大学)，哈尔滨，150040)(内蒙古克什克腾旗林业局森防站)

诱导防御机制在植物自我保护中发挥着重要作用［1］，植物遭受损伤或昆虫取食后，会诱导防御酶表达，促使植物产生大量抗性相关物质。多酚氧化酶(PPO)和苯丙氨酸解氨酶(PAL)是植物体内2种重要的防御酶，它们常被作为植物产生诱导抗性的指示性物质［2-5］。PPO是一类由核基因编码的含铜金属蛋白酶，能够催化一元酚的O-羟基化形成O-二元酚，O-二元酚氧化形成O-二醌。醌是高效的反应中间体，可以迅速聚合成为黑色素或褐色素，影响植物营养价值。在许多植物中，PPO定位于质体内囊体，它的底物一元酚或O-二元酚定位在液泡，正常情况下二者是分离的，当植物受机械损伤、动物啃食、昆虫噬咬、病原菌入侵时，这种空间隔离将被打破，PPO表现出酶活性［6-9］。在酸性条件下(pH＜4)，醌会经受反歧化反应形成半醌活性物质，导致活性氧(ROS)的产生。当pH较高时，醌的亲核加成反应会形成黑或褐色素，同时醌的共价加成也会伴随发生，形成的细胞亲核物质会与昆虫消化蛋白结合［10］。这些次生反应会破坏昆虫DNA、蛋白、油脂［11］。PAL是仅存在于植物和部分微生物体内的酶类。PAL催化L-苯丙氨酸经由非氧化脱氨反应，生成反式肉桂酸和氨，是苯丙烷代谢的首步反应。由此进入植物的次级代谢，可以生成香豆酸、阿魏酸、芥子酸等中间产物，这些化合物进一步可转化为香豆素、绿原酸，也可以形成苯丙烷酸CoA酯，再进一步代谢转化为一系列苯丙素类化合物，如黄酮、木质素、生物碱等。木质素的形成，可以增加细胞壁的厚度，增加组织木质化程度，形成昆虫取食的机械障碍［12］。因此PAL活性可以作为检验植物是否产生诱导抗性的指标，同样也是评价植物抗逆境能力的一个生理指标［13-14］。2种防御酶活性的变化与植物抗虫性密切相关［5，9］。笔者研究剪叶或昆虫取食后，兴安落叶松体内PAL和PPO的活性变化，探讨兴安落叶松体内防御酶活性与诱导因子的关系，为林木诱导抗性研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 供试材料

植物材料为东北林业大学帽儿山实验林场老山试验站网棚内培育的5年生兴安落叶松，苗高(100.0±20.0)cm，当年生枝条16～18枝。昆虫材料为采自林间的落叶松毛虫(Dendrolimus superans)蛹，室内羽化，交配产卵，幼虫孵化后，饲养至3龄备用。

1.2 试验方法

局部剪叶损伤诱导:试验分为剪叶4枝、剪叶8枝和剪叶12枝3种处理，分别在苗的东、南、西、北4个方向各选择1、2、3个枝条，对所选枝条进行剪叶处理。每种处理又分为25%、50%和75%3种不同剪叶程度，具体剪叶方法参照徐伟［15］。在剪叶处理后的0.5、6.0、12.0、24.0、72.0、120.0 h 取样株上未损伤的剩余针叶，装入拉链塑料袋内，迅速放入冰盒，带回实验室冷冻保存。所有处理每个采样时间均设置3个重复，每个重复均处理3株样树。

幼虫取食损伤诱导:在健康苗木的东、南、西、北4个方向各选择1个枝条，将一定数量的3龄幼虫放至所选枝条上，罩上纱笼，当取食量相当于剪叶25%、50%和75%时，将幼虫取下，并分别在处理后的0.5、6.0、12.0、24.0、72.0、120.0 h 取样株上未损伤的剩余针叶，装入拉链塑料袋内，迅速带回实验室冷冻保存。所有处理每个采样时间均设置3个重复，每个重复均处理3株样树。

防御酶活性测定:PPO活性测定参照Stout等［3］，以△OD470 nm 处吸光度变化0.01为1个酶活力单位。PAL活性测定参照 Liu等［16］，以△OD290 nm处吸光度变化0.01为1个酶活力单位。蛋白质含量测定参照Bradford方法［17］，以牛血清蛋白(SIGMA公司)测定标准曲线。

数据分析:使用 SPSS 12.0软件，统计 PAL、PPO活性的平均值和标准差后，采用one-way ANOVA差异显著性分析，以LSD(最小显著法)在0.05和0.01水平下检验与对照之间的差异显著性。

2 结果与分析

2.1 剪叶损伤对松针叶PPO和PAL的系统诱导

2.1.1 损伤对松针叶PPO活性的系统诱导

从表1可见，不同程度剪叶处理后，兴安落叶松未损伤部分针叶内PPO的活性均被迅速强烈诱导，在处理后6 h达到峰值，极显著高于对照，之后PPO活性迅速下降。在24 h时，除4枝50%外，其它损伤程度诱导的PPO活性均迅速下降，在72～120 h酶的活性无显著变化。剪叶4枝50%诱导的PPO活性最强，且酶活性的持续时间较长。

表1 落叶松毛虫取食和剪叶程度不同的兴安落叶松针叶PPO活性 U·mg-1

2.1.2 损伤对松针叶PAL活性系统诱导

不同程度剪叶损伤处理后，兴安落叶松剩余完好针叶内PAL的活性随时间变化显著。剪叶4枝25%时，PAL的活性在24～120 h被强烈诱导，且与对照差异极显著;剪4枝50%、75%诱导的PAL活性高于25%，在处理后的0.5～120 h与对照差异显著或极显著。在损伤后24～120 h，剪叶8枝25%诱导的PAL活性迅速增加，与对照差异极显著;8枝50%、75%诱导的PAL活性在6～120 h与对照差异极显著。剪叶处理后的0.5～72.0 h，12枝25%诱导的PAL活性高于50%、75%，且在损伤后6 h即与对照差异显著;50%、75%在损伤后24～72 h被强烈诱导，并与对照差异极显著。剪叶4枝50%诱导的PAL活性较其它剪叶处理程度的反应更加迅速，且活性最高。

2.2 松毛虫取食对松针叶PPO和PAL的系统诱导

松毛虫取食后0.5～24.0 h，PPO活性极显著高于对照。与剪叶相比，昆虫取食诱导的PPO活性更高，且持续时间更长(表1)。取食4枝25%、75%诱导的PPO活性，在处理后0.5～72.0 h显著高于相同损伤程度剪叶诱导，取食4枝50%诱导的PPO活性，在6～72 h显著高于剪叶4枝50%诱导，且取食4枝50%诱导的酶活性较其它取食程度高。此外，发现昆虫取食诱导PPO活性的反应速度与剪叶诱导无显著差异，酶活性的变化趋势相同。

松毛虫取食诱导PAL活性的变化趋势与剪叶诱导相同，均在处理后72 h表现出较高的活性，只是剪叶4枝50%、75%诱导的PAL活性的反应速度较相同损伤程度松毛虫取食诱导更快，同时发现剪叶4枝50%诱导的PAL活性与相同损伤程度松毛虫取食诱导无显著差异(表2)，说明剪叶或松毛虫取食激发了相同的苯丙氨酸反应途径。

表2 落叶松毛虫取食剪叶程度不同的兴安落叶松针叶PAL活性 U·mg-1

3 结论与讨论

植物总是受到昆虫或其他植食者的伤害，在与昆虫的协同进化过程中，植物自身已经形成一套防御体系以避免或减少昆虫危害，植物防御酶的合成是植物防御体系形成的重要前提［18-22］。不同程度的局部剪叶损伤，能强烈诱导兴安落叶松针叶内PPO和PAL的活性。PPO的活性在处理后的0.5 h显著高于对照，在处理后的6 h达到最大值。剪叶4枝50%诱导的PPO活性最强，且酶活性的持续时间较长。Felton等发现当植物中PPO酶活性增加，会提高绿原酸的氧化作用，增加醌对氨基酸和蛋白的亲核束缚作用［23］。如赖氨酸、组氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸的烷基化，使蛋白难以被昆虫吸收，降低植物的营养价值、消化率及适口性。醌共价修饰的氨基酸可以与昆虫肠胃里的消化酶结合使酶失活，减慢昆虫的生长发育并促使其死亡［9-11］，事实证明松毛虫的消化酶活性在取食24 h显著下降［15］。本研究中，松毛虫取食相同程度的落叶松针叶时，诱导的非损伤部位PPO活性高于剪叶损伤。落叶松毛虫取食诱导的PPO活性在短暂升高后也迅速下降。袁红娥［24］研究结果表明松毛虫取食后，兴安落叶松绿原酸含量下降。这表明了PPO参与兴安落叶松的防御反应，消耗了部分绿原酸，在兴安落叶松的早期抗性反应中发挥较大作用。

PAL是仅存在于植物和部分微生物体内的酶类。许多试验证明，PAL活性高低与植物的抗虫性有很大关系。蚜虫侵染大麦、棉花后，引起PAL活性升高，在大麦中抗蚜品种的PAL活性以及水杨酸的含量均高于敏感品种［5］。本研究中，不同程度的局部剪叶损伤，均能强烈诱导兴安落叶松针叶内PAL的活性。剪叶4枝50%诱导的PAL活性较其它剪叶处理程度的反应更加迅速，且活性最高。与剪叶相比，松毛虫取食诱导了较高的PAL活性，剪叶4枝50%诱导的PAL活性与相同损伤程度松毛虫取食诱导无显著差异。剪叶或松毛虫取食很有可能激发了相同的苯丙氨酸反应途径。PAL催化产生的黄酮类、生物碱及木质素能够有效封闭创伤、防止松毛虫的进一步取食。不同类型品种棉花在棉蚜为害胁迫下，PAL和多酚类含量均有不同程度上升，且抗蚜品种上升快［25-26］;用棉铃虫处理棉花后发现，随PAL活性的增加，与细胞壁结合的酚类化合物大量积累［27］。这些研究印证了本研究结果以及PAL在落叶松中的抗虫作用。

相对PPO，剪叶诱导PAL的反应相对迟缓，但其持续时间较长，在120 h时，酶的活性仍保持较高水平，与对照差异极显著。Neuvonen等［28］指出，植物的诱导防御甚至在叶片被取食后的1年内都有效，木本植物的诱导抗性具有较长的滞后性，一棵树体要恢复到被害前的状态，即消除诱导防御的作用，至少需要3～4 a。因此推测PAL可能在兴安落叶松的滞后性诱导抗性中发挥重要作用。

不同程度的局部剪叶损伤，均能强烈诱导兴安落叶松针叶内PAL和PPO的活性，但酶活性并没有因损伤程度的增加而增加。剪叶4枝50%诱导的PAL活性较其它剪叶处理程度的反应更加迅速，且活性最高。剪叶8枝、12枝诱导的PAL活性并没有显著高于4枝，并且在损伤后的120 h，PAL较剪叶4枝低。剪叶8枝、12枝诱导的PPO的活性低于剪叶4枝，且剪叶4枝所诱导的PPO活性的持续时间较长。说明利用损伤诱导植物防御反应过程中存在阈值。当超过这个限度时，植物的防御能力非但不能增加反而会下降，不能提供足够的有效成分防御外来威胁。从本研究的结果可以看出，以剪叶4枝50%诱导的防御酶的活性最高，持续性最强。

以上的讨论总结出，兴安落叶松的PPO和PAL均在其抗损伤和松毛虫危害的过程中发挥了重要作用。PPO是兴安落叶松先期防御的重要酶，能够改变植物蛋白的结构，其作用不可忽视。PAL作为苯丙烷代谢的关键酶，在兴安落叶松即时及滞后性诱导防御中发挥巨大作用。不同激发子诱导的兴安落叶松防御反应存在一定差异，但这种差别只表现在防御物质的量上，松毛虫取食与机械损伤诱导的PPO和PAL的激活速度以及酶活性的变化趋势具有较高的拟合度，这似乎说明2种方法诱导防御反应机制并没有本质区别。在以往对被子植物的研究中，也曾出现类似的结果［29］。因此，有望使用机械损伤从作用时间和作用方式上拟合昆虫取食，诱导增强兴安落叶松自主抗虫能力，使预防和防治害虫危害达到理想的效果。

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