甘草酸二铵对人肝癌细胞SMMC－7721增殖和p53表达的影响＊

张剑锋，李 浩，李超乾△，赵春菱，唐华民，严若谷

（广西医科大学第一附属医院：1.急诊科；2.研究生院，南宁530007）

甘草酸二铵（diammonium glycyrrhizinate，DG）是从中药甘草（glycyrrhiza）中提取的一种有效活性单体化合物［1］，具有较强的抗炎、抑制肝纤维化和肝炎病毒增殖的作用［2－6］。据国内外文献报道，长期使用复方甘草酸苷能预防肝硬化的发生，且明显减少肝癌的发病率［7－8］，但DG对肿瘤是否具有抑制增殖作用，目前尚缺乏相关研究。本实验拟通过体外实验，探讨DG对人肝癌细胞株SMMC－7721细胞体外增殖的抑制作用，以及其对抑癌基因p53表达的影响。

1 材料与方法

1.1材料 人肝癌细胞SMMC－7721购自中国科学院上海细胞库，DG注射液购自江苏正大天晴制药有限公司；RIPM1640培养液购自Thermo Scientific公司，胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料技术有限公司，琼脂糖购自上海生工生物工程技术服务有限公司，Trizol购自美国Invitrogen公司，PCR扩增引物购自上海生工生物工程技术服务有限公司，逆转录试剂盒购自美国Promega公司，蛋白提取试剂购自上海碧云天生物技术研究所，鼠抗－p53单克隆抗体购自美国Santa Cruz公司，辣根过氧化物酶（HRP）标记抗小鼠IgG购自北京中杉金桥试剂公司。CO2培养箱购自美国Forma scientific Inc公司，超净工作台购自苏州净化设备厂，酶联免疫检测仪Model－450购自美国Bio－Rad公司，倒置相差显微镜购自日本Olympus公司，Gel doc 2000凝胶成像分析系统购自美国Bio－Rad公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养及分组 肝癌细胞用含10%胎牛血清的RPMI1640培养基培养，并加入青霉素100U/mL，链霉素100 μg/L，置于37℃含5%CO2孵箱中培养。实验用细胞均处于对数生长期，常规苔盼蓝计数活细胞大于95%。实验细胞分为对照组及DG干预组，其中对照组（DG 0）未采用任何药物干预，而DG干预组则加入DG终浓度分别为0.50、1.00、2.00、4.00、8.00、16.00mg/L进行共同孵育。

1.2.2MTT法测定细胞增殖抑制率 取处于对数生长期的细胞用胰蛋白酶消化后，离心，接种于96孔板，培养12h，分别加入不同浓度DG，孵育48h后加入10μL MTT（5mg/mL），继续培养4h后加入二甲基亚砜（DMSO）150微升/孔，酶标仪570nm/630nm测定吸光度值（OD值），计算细胞存活率。存活率（%）＝用药组OD值/对照组OD值×100%。用软件B1iss计算IC50。

1.2.3实时荧光定量PCR测定p53基因的表达

1.2.3.1引物设计与合成 从Gene Bank中查找p53及内参GAPDH基因的全长序列，采用软件Primer5.0和oligo 6.0设计上、下游引物。p53 上游：5′－GGC CCA CTT CAC CGT ACT AA－3′，下游：5′－GTG GTT TCA AGG CCA GAT GT－3′；GAPDH 上游：5′－AAC GGA TTT GGT CGT ATT G－3′，下游：5′－CTG GAA GAT GGT GAT GGG－3′，并通过 Gene Bank进行blast比对。

1.2.3.2样品制备 收集 DG 0.00（对照组）、2.00（低浓度组）、4.00（中浓度组）、8.00（高浓度组）mg/L处理48h后的SMMC－7721细胞，采用总RNA提取试剂盒提取细胞总RNA，然后逆转录成cDNA，得到的样品作为PCR模板。

1.2.3.3RT－PCR法检测p53mRNA表达 RT－PCR反应体系反应条件为：95℃5min，95℃30s，59℃45s，72℃30s，共40个循环。测定样品p53和GAPDH的Ct值，△Ct＝Ct目的基因－Ct内参基因。根据△△Ct＝△Ct干预组－△C对照组，计算

1.2.4Western blot测定p53蛋白表达 收集经DG预处理的细胞，加入0.20mL蛋白裂解液冰上裂解30min，4℃12 000r/min离心30min，取上清液，测定蛋白样品浓度，取60 μg总蛋白上样，100℃5min，10%十二烷基硫酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS－PAGE）2h，加入鼠抗人p53单克隆抗体，4℃孵育过夜，加入HRP标记抗鼠IgG，同时加入HRP标记鼠抗GAPDH的单克隆抗体作为内参。室温孵育1h，暗房进行压片、显影、定影，底片经LEICA Q2550IW图像处理系统分析，测定各条带的光密度值，进行定量分析［9］。

1.3统计学处理 采用SPSS13.0统计软件进行分析，实验数据用s表示，运用t检验，以P＜0.05为差异有统计意义。

2 结 果

2.1DG对SMMC－7721细胞增殖的影响 DG对SMMC－772l细胞具有明显的增殖抑制作用。DG呈浓度依赖性降低细胞的存活率（图1）。DG剂量为4.00、8.00、16.00mg/L时其抑制率分别为44.52%、66.78%、91.24%。倒置显微镜下观察，与对照组比较，DG作用后，细胞形态逐渐变得不规则，细胞质内出现空泡，大部分细胞贴壁不良，细胞膜出现皱缩、细胞变圆、脱落凋亡，且此现象随着DG浓度增大而更为明显，DG 0、2.0、4.0、8.0mg/L作用细胞48h显微镜观察图片见图2。DG作用SMMC－772l细胞48h的IC50值为（4.31±0.21）mg/L。

图1 DG对SMMC－7721细胞增殖的抑制作用

2.2p53mRNA表达水平的变化 DG 2.00、4.00、8.00mg/L预处理48h后，p53mRNA表达明显上调，分别为2.12±0.186、2.56±0.102、2.68±0.211，与对照组（1.08±0.211）比较，差异均有统计学意义（P＜0.01）。

2.3p53蛋白表达的变化 与对照组比较，DG （2.00、4.00、8.00mg/L）预处理SMMC－7721细胞48h后，p53蛋白表达明显提高，见图3。

图2 各组SMMC－7721细胞显微镜观察图像（10×10）

图3 Western blot检测p53蛋白表达

3 讨 论

肝癌为世界上恶性程度极高的恶性肿瘤之一，其预后极差。每年全球约有125万人患病，而在我国肝癌处于恶性肿瘤病死率的第2位，广西尤其为肝癌高发地区，对人民群众健康造成极大威胁。近年来，肝癌的病因学研究已取得很大进展，认为肝癌的发生是在遗传易感性的基础上，各种环境致癌因子的作用，以致体细胞多种原癌基因激活及抑癌基因的失活，最终导致细胞生长、增殖、分化发生紊乱的结果［10］。如能寻找有效药物抑制原癌基因激活或者抑癌基因的失活，则可能对肝癌的治疗效果有显著提高。

DG是从中药甘草中提取的一种有效成分，现代研究表明，DG具有抗炎，抗病毒（肝炎病毒、艾滋病病毒等），防治肿瘤和保护肝细胞等多方面作用［11－13］，临床应用广泛。但其对肝癌细胞增殖是否有抑制作用，目前未见相关报道。本实验采用不同浓度的DG作用于肝癌细胞SMMC－7721，MTT法测定结果显示细胞生长受到明显的抑制，作用细胞48h后的IC50值为（4.31±0.21）mg/L，表明DG具有较强抑制肿瘤细胞增殖作用，且这种抑制作用具有浓度依赖性。

为了进一步阐明DG抑制肝癌细胞增殖的作用机制，本实验选取了与肝癌发生过程有着密切联系的p53基因进行分子水平研究。p53基因与肿瘤发生有很高的相关性［14］。本研究结果显示，DG上调了p53基因及其蛋白的表达，但其具体调节机制尚未明确。p53是细胞凋亡反应和细胞周期调控的重要因子，在人类多种肿瘤中均具有较高的突变率，将p53用于肿瘤基因治疗可能具有潜在应用价值。不少证据表明p53与肝癌发生的过程有着密切的联系［15－16］。本研究小组将对DG调控p53的具体调节机制进一步研究，下一步将建立肝癌在体动物模型，以证实DG对肝癌作用的特异性与有效性，以期尽早明确DG对肝癌的可能治疗作用及其机制。

综上所述，DG能明显抑制肝癌细胞的过度增殖，其可能通过上调p53基因和蛋白表达，加速细胞凋亡，从而达到抑制肿瘤细胞恶性增殖的效果，但其对p53的具体调控机制尚待进一步研究明确。

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