5脂氧合酶在食管鳞癌组织中的表达及其临床意义

李现杰，王忠民△，张明香

（新乡医学院第一附属医院：1.心胸外科；2麻醉科，河南新乡453100）

食管癌是上消化道最常见的恶性肿瘤之一，多数为食管鳞状上皮细胞癌（ESCC）。国内外近年研究结果表明，花生四烯酸（arachidonic acid，AA）代谢异常参与肿瘤的发生。脂氧合酶（lipoxygenase，LOX）代谢通路是参与AA代谢的重要途径，其关键酶是LOX，5－LOX是其同工酶中的一种，参与多种肿瘤的发生。但5－LOX在ESCC发生、发展中的作用和生物学意义尚不清楚。本文通过检测5－LOX基因在ESCC中的表达情况，分析探讨其与ESCC发生、发展的关系及其临床生物学意义。

1 资料与方法

1.1一般资料 收集2011年5～9月本院心胸外科行食管癌根治术手术切除的新鲜ESCC组织标本53份（ESCC组）和部分病例相应的癌旁组织（距癌组织边缘大于6cm）36份（对照组），所取组织标本均由2位病理学专家检查确诊。男39例，女14例；年龄43～72（59.0±7.80）岁，所有患者术前均未行化疗和放疗。主要试剂：TRIzol试剂、DNA Ladder购自生工生物工程（上海）有限公司；RT－PCR试剂盒购自宝生物（大连）工程有限公司；SP试剂盒、DAB显色试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司；兔抗人5－LOX单克隆抗体购自北京博奥森生物技术有限公司。设计引物序列5－LOX上游：5′－CCC GGG GCA TGG AGA GCA－3′，下游：5′－GCG GTG GGG CAG CGT GTC－3′；β－actin 上 游：5′－CTA TTG GCA ACG AGC GGT TC－3′，下游：5′－CTT AGG AGT GGG GGT GGC－3′，扩增片段长度分别为416bp和776bp，均由生工生物工程（上海）有限公司合成。

1.2方法

1.2.1RT－PCR检测5－LOX mRNA表达 取约100mg组织放入盛有液氮的研钵中研磨，加入1mL TRIzol液研磨成粉末，按照TRIzol RNA提取试剂盒操作说明步骤进行，将提取到的总mRNA溶解于40μL经DEPC处理过的去离子水中后－80℃冰箱保存备用，用1%琼脂糖凝胶电泳及紫外分光光度计分析判断总RNA的完整性及含量和纯度。严格按照RNA PCR Kit（AMV）Ver.3.0试剂盒说明书配制反转录反应液，每份反应液加入1μL样品DNA，混匀后在50℃条件下反应20min，95℃条件下5min，5℃条件下5min，进行1个循环。再向上述反应产物中加入PCR Buffer 10μL、特异下游引物0.5μL及 TaKaRa Ex Taq®HS 0.25μL，并用无菌蒸馏水补至40μL，混匀后用PE2400仪进行扩增反应。94℃预变性5min后，按以下反应条件进行30个循环：94℃→30s、59℃→30s、72℃→1min，最后72℃延伸7min，4℃条件下保存。以高压处理后的DEPC水代替样品mRNA的反应体系为空白对照，以β－actin引物代替5－LOX引物的反应体系为内对照。取上述PCR反应产物5μL在1%的琼脂糖凝胶上，以110V，90mA条件下进行电泳约30min，结果经UVIpro紫外凝胶成像及分析系统观察、扫描、拍照，分析图片中5－LOX和β－actin的表达强度，并计算表达的相对系数（即5－LOX基因表达强度/β－actin的表达强度）。

1.2.2免疫组化SP法检测5－LOX蛋白表达 将组织标本常规脱水、石蜡包埋，4μm厚连续切片，脱蜡至水，再按照免疫组化SP试剂盒说明书进行免疫组化染色，一抗工作液浓度以1∶200稀释，以0.1mol/L PBS代替一抗作阴性对照，DAB显色，苏木素复染，盐酸乙醇分化，常规脱水透明后中性树胶封片。显微镜下观察染色结果：以细胞核、核膜或细胞质中出现棕黄色细颗粒为阳性细胞。利用图像分析软件Image－Pro Plus 5.0分析结果，测定5－LOX蛋白表达的灰度值，每片随机取5个高倍镜视野，取其平均值记录为5－LOX蛋白表达的灰度值。

1.3统计学处理 采用SPSS17.0统计软件对所记录数据进行分析。采用s表示，计量资料使用t检验及单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

所有标本组织经RT－PCR产物电泳后，均可观察到长度为776bp内参条带。ESCC组组织中5－LOX mRNA的相对表达系数为0.389～0.982，平均为0.659±0.155，对照组相对表达系数为0.216～0.580，平均为0.382±0.108，两组比较差异有统计学意义（P＜0.05）；ESCC组组织中5－LOX蛋白表达的灰度值为46.094～58.549，平均为51.853±3.793，对照组表达灰度值为31.535～43.535，平均为37.112±3.404，两组比较差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。ESCC组织中5－LOX mRNA表达水平在高分化组明显低于中、低分化组，临床分期为Ⅲ、Ⅳ期的病例明显高于分期为Ⅰ、Ⅱ期的病例（P＜0.05），此外其表达水平还与肿瘤的淋巴转移及外膜的浸润有关（P＜0.05）；5－LOX蛋白表达水平也与肿瘤的外膜浸润、分化程度、有无淋巴结转移及临床分期有关（P＜0.05），见表2。

表1 5－LOX在两组标本组织中的表达比较（s）

表1 5－LOX在两组标本组织中的表达比较（s）

53 0.659±0.155 51.853±3.793对照组 36 0.382±0.108 37.112±3.404 t 9.886 19.138 P 5－LOX蛋白表达灰度值ESCC组组别 n 5－LOX mRNA相对表达系数0.000 0.000

表2 ESCC病理特征与5－LOX表达情况（s）

表2 ESCC病理特征与5－LOX表达情况（s）

临床特征 n 5－LOX mRNA相对表达系数 P 5－LOX蛋白表达灰度值P外膜浸润有25 0.715±0.156 0.011 53.255±3.655 0.010无28 0.608±0.139 50.602±3.520分化程度高分化 19 0.562±0.138 0.000 49.525±3.390 0.000中分化 23 0.677±0.122 52.316±3.333低分化 11 0.786±0.148 54.907±2.937淋巴转移有19 0.731±0.173 0.010 53.509±4.024 0.016无34 0.618±0.131 50.928±3.372临床分期Ⅰ期 1 0.416±0.000 0.014 46.325±0.000 0.036Ⅱ期 26 0.628±0.130 51.202±3.424Ⅲ期 24 0.679±0.159 52.285±3.818Ⅳ期

3 讨 论

近年来研究发现，AA代谢异常与肿瘤的发生、发展密切相关［1－4］，AA主要通过环氧合酶途径、LOX途径及细胞色素P450途径代谢，产生前列腺素类（PGs）、血栓素 A2（TXA2）、羟二十碳四烯酸（HETEs）和白细胞三烯（LTs）以及环氧化二十碳三烯酸（EETs）等代谢产物，统称为类花生酸。这些产物与肿瘤的发生、增殖、转移和凋亡等生物学活性行为密切相关［5－6］。

5－LOX基因定位于第10号染色体p11.2亚带，随合成该酶的白细胞不同其编码的蛋白相对分子质量为（72～80）×103，5－LOX代谢通路异常可促进多种肿瘤的发生、发展，这一作用已在许多肿瘤组织如胃癌、胰腺癌、结肠癌、前列腺癌、肺癌和乳腺癌等中证实。5－LOX高表达能够促进细胞的恶性增殖、阻止其凋亡，同时可以促进肿瘤血管的形成，增强其转移的能力，提高侵袭力。相关研究发现，给予5－LOX特异性抑制剂后可以显著抑制肿瘤细胞的增殖［7－8］。

Hoque等［9］采用免疫组化等技术对食管癌的研究发现，5－LOX蛋白在食管癌组织中表达水平上调，而且其表达水平与肿瘤的分化程度及淋巴结转移密切相关。本文联合采用RT－PCR及免疫组化技术发现在ESCC组织和癌旁正常食管组织中均有5－LOX表达，ESCC组织中（其mRNA的相对表达系数平均为0.659±0.155，5－LOX 蛋白表达的灰度值平均为51.853±3.793）呈高表达，与对照组（mRNA的相对表达系数平均为0.382±0.108，蛋白表达的灰度值平均为37.112±3.404）比较差异有统计学意义（P＜0.05），而且肿瘤分化程度越差其表达水平越高，5－LOX不仅调剂正常食管组织的生长，而且在ESCC的发生中起着更为重要的作用。结合临床主要相关参数分析发现5－LOX在肿瘤临床分期低的较分期高的表达程度要高，出现外膜浸润及淋巴结转移时其表达水平亦偏高，提示5－LOX的高表达能够提高食管癌的转移能力并增强其侵袭力。淋巴结转移可作为影响肿瘤预后的独立因素，5－LOX的高表达提示食管癌的患者预后不良。

本研究提示5－LOX可能在ESCC的发生、发展中起着重要的作用，对食管癌的临床诊治提供了新的方法和实验室依据。近年来利用5－LOX特异性抑制剂治疗肿瘤的研究已成为热点，并有望能够成为治疗ESCC的新途径。

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