肠毒性大肠埃希菌肠毒素LTa基因特异性EMA－PCR 检测方法的建立

赵素君，曹 冶，谢 晶，李江凌，王秋实，叶勇刚，罗丹丹，叶健强，廖党金

（四川省畜牧科学研究院，四川 成都 610066）

肠毒性大肠埃希菌（Enterotoxigenic Escherichia coli，ETEC）是幼畜腹泻的重要病原菌，在临床上可引起幼畜急性严重腹泻。该病发病率高，传染性强，肠毒素是ETEC的直接致病因子[1－4]。由于PCR技术特异性强、灵敏度高和准确快速等优点，肠毒素基因的PCR扩增已经被越来越多地应用于肠毒性大肠埃希菌的检测[5－8]。但传统PCR技术无法区分样品中的死细菌与活细菌，在活菌DNA和死菌DNA中均能扩增出目的基因[9－10]。死菌DNA的存在，也同样被检测到，其结果会导致过高估计活菌数量，并可能在没有活菌存在的情况下也会出现阳性检测结果（假阳性），从而干扰检测结果的真实性。

叠氮溴乙锭（ethidium monoazide bromide，EMA）是一种荧光插入型核酸结合染料，能穿过死细菌的细胞膜，在光激活的作用下与基因组DNA共价结合，从而能抑制样品中死菌体的DNA扩增；而活细菌因具有完整的细胞膜而能阻止EMA渗透，使EMA对活菌体的DNA不起作用[11－14]。该技术在国内尚未见报道。本研究将EMA与PCR技术结合，在PCR扩增肠毒素基因目的片段的检测过程中，通过EMA选择性地与混合细菌菌落中的死细胞DNA共价结合，除去死细菌DNA对PCR扩增的干扰，可大大提高检测的准确性，以建立一种快速、有效的检测肠毒性大肠埃希菌活细菌的方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 阳性菌株：肠毒性大肠埃希菌CVCC196、CVCC197、CVCC200；对照菌株：肠出血性大肠埃希菌CVCC248，肠侵袭性大肠埃希菌CVCC2072，肠致病性大肠埃希菌CVCC251，金黄色葡萄球菌CVCC3055、CVCC3056，猪霍乱沙门菌CVCC504，均购自中国兽医药品监察所中国兽医微生物菌种保存管理中心。

1.1.2 主要试剂 EMA为Biotium公司产品；Taq DNA聚合酶、dNTPs、DNA Marker DL 2000为宝生物工程（大连）有限公司产品；其他化学试剂均为国产分析纯试剂；引物合成及核酸测序由Invitrogen公司完成。

1.1.3 引物设计与合成 根据GenBank中肠毒性大肠埃希菌不耐热肠毒素基因LTa设计引物。引物序列为 F：5′－GCGACAGATTATACCGTGC－3′；R：5′－GGTCTCTATATTCCCTGTT－3′，扩增目的条带大小为438bp。

1.2 方法

1.2.1 肠毒性大肠埃希菌活菌和死菌的制备 接种肠毒性大肠埃希菌，培养16h后，取1mL菌液于EP管中，6000r／min，4℃，离心5min，收集菌体沉淀，加入无菌生理盐水重悬沉淀，制成活菌悬液。取部分活菌悬液，72℃水浴15min，得到死菌悬液。

1.2.2 EMA处理 取适量菌悬液于EP管中，加入终浓度为100μg／mL的EMA，在黑暗处放置5 min后，于650W卤素光源光照处理1min，光源放在离样品管20cm处，光照时EP管放在冰上，以免样品温度过高。EMA处理后的样品，用于模版DNA的制备。

1.2.3 模版DNA的制备 取1mL菌液，12000 r／min离心5min，去除上清液，用100μL灭菌去离子水重悬，然后于100℃水浴5min后，10000 r／min离心5min，上清液用作PCR检测。

1.2.4 PCR反应体系及反应条件优化 PCR反应体系：10×Ex Taq buffer（含 MgCl2）2.5μL，dNTP mixture（各2.5mmol／L）2μL，引物 F（20 μmol／L）0.5μL，引物 R（20μmol／L）0.5μL，模板DNA 1μL，TaKaRa Ex Taq（5U／μL）0.25μL，灭菌双蒸水加至25μL。

PCR反应条件优化主要通过退火温度来实现，为了获得特异性的扩增片段，采用Touchdown PCR方法确定PCR反应合适的退火温度，设定退火温度范围65℃～45℃。扩增结果经10g／L琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.5 特异性检测 用肠毒性大肠埃希菌CVCC196、CVCC197、CVCC200作为阳性菌株，以CVCC248、CVCC2072、CVCC251、CVCC3055、CVCC3056、CVCC504作为阴性对照，进行PCR扩增，PCR反应产物经10g／L琼脂糖凝胶电泳检测，用凝胶成像系统进行观察，出现特异性扩增条带，即为检测阳性，否则为阴性。

1.2.6 灵敏度检测 接种肠毒性大肠埃希菌CVCC196，培养16h，取1mL菌液于EP管中，递倍稀释10－1～10－9，PCR检测其灵敏度。同时，采用平板法进行细菌计数，通过牛肉膏蛋白胨琼脂平板进行对照计数，分别取递倍稀释100～10－9的菌液50μL进行涂板，37℃培养过夜，然后分别进行计数，计算检测灵敏度。

1.2.7 不同活菌比例的混合菌悬液的EMA－PCR扩增 分别配制含有1000、750、500、300、200、100、50、40、30、20、10、0mL／L 的肠毒性大肠埃希菌CVCC196活细胞菌悬液混合体系，分别加入终浓度为100μg／mL的EMA，在黑暗处放置5min后，样品置于冰上用650W卤素光源距离20cm处光照处理1min，经EMA处理后的菌液，用于如上DNA模版的制备，进行PCR扩增，PCR反应产物进行琼脂糖凝胶电泳分析。

1.2.8 EMA－PCR检测灵敏度的干扰试验 取肠产毒性大肠埃希菌CVCC196纯菌液的活细胞和死细胞悬液各250μL，用PBS缓冲液进行递倍稀释10－1～10－9，分别取50μL进行涂板，37℃培养过夜，然后分别进行计数，计算检测灵敏度。同时，分别取50μL混入450μL的其他杂菌中，进行EMA－PCR检测，PCR反应产物进行琼脂糖凝胶电泳分析。

2 结果

2.1 PCR反应条件的优化结果

经过Touchdown PCR方法确定最佳的PCR反应条件为：94℃4min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，28个循环；72℃延伸5min。扩增结果经10 g／L琼脂糖凝胶电泳检测，出现大小为438bp的特异性目的条带（图1）。

图1 肠毒性大肠埃希菌PCR检测结果Fig.1 PCR results of the enterotoxigenic Escherichia coli

2.2 PCR特异性检测结果

PCR特异性检测结果见图2。PCR检测结果经琼脂糖凝胶电泳分析，只有肠毒性大肠埃希菌CVCC196、CVCC197和CVCC200扩增出目的条带，而对照菌株CVCC248、CVCC2072、CVCC251、CVCC3055、CVCC3056和CVCC504未出现特异性条带。

图2 PCR检测的特异性试验Fig.2 The specific test results of PCR

2.3 PCR灵敏度检测结果

各梯度稀释液的PCR扩增结果经琼脂糖凝胶电泳分析（图3），其灵敏度检测低限为10－9，而相应的平板计数为19cfu／mL。

图3 PCR检测的灵敏性试验Fig.3 The sensitive test results of PCR

2.4 EMA－PCR区分死菌与活菌的检测结果

EMA－PCR扩增结果见图4。结果显示除了全部是死菌的组外，其他含活菌各种比例的混合菌液中，均出现特异性扩增条带。

图4 EMA－PCR对肠毒性大肠埃希菌活菌／死菌混合物的检测Fig.4 The detection for live and dead bacteria mixture of ETEC by EMA－PCR

2.5 EMA－PCR检测灵敏度的干扰试验结果

模拟混合杂菌液以9∶1的比例对活菌和死菌混合悬液各梯度稀释液进行干扰，EMA－PCR扩增结果经琼脂糖凝胶电泳分析结果如图5所示。其灵敏度检测低限为10－8，而相应的平板计数为24cfu／mL。结果表明，模拟混合杂菌的干扰基本没有影响其检测的灵敏度。

图5 EMA－PCR检测灵敏度的干扰试验Fig.5 Effect on sensitivity of the EMA－PCR detection by interference experiment

3 讨论

目前，对ETEC的检测和鉴定仍然停留在病原分离培养、生化试验等传统方法的水平上，这些方法虽然确实可靠，但繁琐、费时、灵敏性不高。而PCR方法在病原体检测和鉴定方面不仅敏感、特异，而且简便、快捷，但常规PCR技术无法区分样品中的死细菌与活细菌，常常因死菌的存在而使检测结果出现假阳性，干扰检测的真实性。

本研究将EMA的选择渗透性和PCR的特异灵敏性相结合建立的EMA－PCR方法，可以特异地检测样品中的活菌，操作简单、快速，不需要复杂的DNA提取步骤，具有很好的特异性和较好的敏感性。该方法的检测灵敏度达19cfu／mL，通过模拟混合杂菌液对EMA－PCR检测灵敏度的干扰试验，结果显示检测灵敏度为24cfu／mL，表明模拟混合杂菌的干扰基本没有影响其检测的灵敏度。在本试验中，肠毒性大肠埃希菌细胞的热致死条件为72℃水浴15min，Wang S等[15]对创伤弧菌的热致死条件是100℃作用5min；Nogva H K等[16]对大肠埃希菌、单核细胞增生性李斯特菌以及沙门菌的致死条件是72℃或者100℃加热5min，或者使用700 mL／L的异丙醇等致死方法。因此认为，不同的活菌细胞致死方法可能会影响到所需要的EMA浓度以及EMA结合效率。EMA－PCR作为一种新型的检测技术，能够有效区分病原菌的死细胞与活细胞，利用该方法可避免因分析的样品中含有死细菌而造成的假阳性检测结果，检测的准确性和真实性较传统PCR大大提高。EMA－PCR检测肠毒性大肠埃希菌活细菌技术的建立在病原菌的临床检测以及养殖场环境的监测中均具有重要的实际应用价值和良好的应用前景。

[1]El－Mohamady H，Francis W，Shaheen H，et al.Detection of fecal and serum antibodies against enterotoxigenic E.coli toxins and colonization factors in deployed U.S.military personnel during operation bright star 2001－－Egypt[J].Egypt J Immunol，2006，13（1）：189－198.

[2]Gilligan P H.E.coli.EAEC，EHEC，EIEC，ETEC[J].Clin Lab Med，1999，19（3）：505－521.

[3]Sabui S，Dutta S，Debnath A，et al.Real－time PCR－based mismatch amplification mutation assay for specific detection of CS6－expressing allelic variants of enterotoxigenic E.coli and its application in assessing diarrheal cases and asymptomatic controls[J].J Clin Microbiol，50（4）：1308－1312.

[4]Niewold T A，van der Meulen J，Kerstens H H，et al.Transcriptomics of enterotoxigenic E.coli infection.Individual variation in intestinal gene expression correlates with intestinal function[J].Vet Microbiol，141（1－2）：110－114.

[5]Yano A，Ishimaru R，Hujikata R.Rapid and sensitive detection of heat－labile I and heat－stable I enterotoxin genes of enterotoxigenic E.coli by loop－mediated isothermal amplification[J].J Microbiol Meth，2007，68（2）：414－420.

[6]Reischl U，Youssef M T，Wolf H，et al.Real－time fluorescence PCR assays for detection and characterization of heat－labile I and heat－stable I enterotoxin genes from enterotoxigenic E.coli[J].J Clin Microbiol，2004，42（9）：4092－4100.

[7]Grant M A，Hu J，Jinneman K C.Multiplex real－time PCR detection of heat－labile and heat－stable toxin genes in enterotoxigenic E.coli[J].J Food Prot，2006，69（2）：412－416.

[8]Lothigius A，Janzon A，Begum Y，et al.Enterotoxigenic E.coli is detectable in water samples from an endemic area by real－time PCR[J].J Appl Microbiol，2008，104（4）：1128－1136.

[9]Keer J T，Birch L.Molecular methods for the assessment of bacterial viability[J].J Microbiol Meth，2003，53（2）：175－183.

[10]Nocker A，Camper A K.Selective removal of DNA from dead cells of mixed bacterial communities by use of ethidium monoazide[J].Appl Environ Microbiol，2006，72（3）：1997－2004.

[11]Rudi K，Moen B，Dromtorp S M，et al.Use of ethidium monoazide and PCR in combination for quantification of viable and dead cells in complex samples[J].Appl Environ Microbiol，2005，71（2）：1018－1024.

[12]Bolton P H，Kearns D R.Spectroscopic properties of ethidium monoazide：a fluorescent photoaffinity label for nucleic acids[J].Nucleic Acids Res，1978，5（12）：4891－4903.

[13]Lee J L，Levin R E.A comparative study of the ability of EMA and PMA to distinguish viable from heat killed mixed bacterial flora from fish fillets[J].J Microbiol Meth，2009，76（1）：93－96.

[14]Lee J L，Levin R E.Discrimination of viable and dead Vibrio vulnificus after refrigerated and frozen storage using EMA，sodium deoxycholate and real－time PCR [J].J Microbiol Meth，2009，79（2）：184－188.

[15]Wang S，Levin R E.Discrimination of viable Vibrio vulnificus cells from dead cells in real－time PCR[J].J Microbiol Meth，2006，64（1）：1－8.

[16]Nogva H K，Dromtorp S M，Nissen H，et al.Ethidium monoazide for DNA－based differentiation of viable and dead bacteria by 5′－nuclease PCR[J].Biotechniques，2003，34（4）：804－808，810，812－813.