镉对泥鳅肝脏及其过氧化氢酶的影响

王杨科，路宏朝，王 琦

（陕西理工学院生物科学与工程学院，陕西 汉中 723000）

镉（cadmium，Cd）广泛分布于自然界中，是世界自然基金会（World wide fund for nature，WWF）确认的水生生态环境中最重要的重金属污染物[1－2]。具有污染范围广、持续时间长、毒性强、难以降解以及能沿食物链转移富集、污染后不易被发现等特点，对水生生物和人体产生严重的危害[3－5]。低浓度的镉对鱼类产生较强的毒性效应，导致各组织器官如鳃、肝、肾、脑等出现广泛的损害，引起生长和繁殖异常，甚至死亡[6]。有研究显示，肝脏是体内最初镉积累和产生毒性的主要部位[7]。

泥鳅（Misgurnus anguillicadatus）是一种良好的土壤与水域环境污染的监测动物，属鲤形目（Cypriniformes），鳅科（Cobitidae）泥鳅属，分布极为广泛，取材方便，不受季节限制，抗病能力较强，食性广。因此，近年来常被用来检测水体的污染情况，评价污染物对水生生物的遗传损害及毒理效应等[8－9]。本研究以泥鳅为实验动物，采用生物毒性试验，研究镉对泥鳅肝脏的损伤和过氧化氢酶活性的影响，从而探讨镉对鱼类的毒害机制，间接检测环境的污染情况，并对泥鳅的抗逆机制作初步研究，为发展渔业生产和水体中金属污染防治提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验用动物 泥鳅购自陕西省汉中市水产市场，体长13.0cm±1.8cm，体重13.4g±1.4g。动物在曝气2d的自来水中暂养5d后，挑选体格健壮、体表无损伤、个体差异较小的泥鳅作为试验泥鳅。

1.1.2 试剂和仪器 氯化镉（CdCl2·2.5H2O，分析纯），天津市苏庄化学试剂厂产品；其它试剂均为化学分析纯试剂。生物研究显微镜（E600），尼康公司产品。

1.2 方法

1.2.1 染毒 采用静水养殖法[4]，根据国家渔业水质标准（Cd2＋：≤0.005mg／L），并结合文献[5]，设置0.05、0.5、5.0mg／L 3个浓度的Cd2＋染毒组，以曝气2d以上自来水为阴性对照组，每组取12尾，试验设立两个平行试验组。每组的染毒溶液15L，染毒时间分别为2、4、6、8、10d。

1.2.2 制作肝组织石蜡切片 染毒6d后，迅速采集肝组织，石蜡包埋，HE染色，光学显微镜观察[6]。

1.2.3 过氧化氢酶活性 参照文献[7]，用滤纸吸干肝脏、称重，加入4℃的0.25mol／L蔗糖溶液10 mL／g，匀浆，以1500r／min离心5min，取上清液，用0.25mol／L蔗糖溶液将其稀释20倍，置于4℃待测。采用硫代硫酸钠（Na2S2O3）滴定法测定过氧化氢酶活性，各染毒组、对照组均加入0.01mol／L（pH6.8）H2O2磷酸缓冲液5mL；于25℃水浴中恒温1min；染毒组加入酶液1mL，对照组加1mL纯净水，混匀，25℃水浴中保温3min；加入0.5mol／L H2SO4溶液2mL，100g／L KI溶液0.5mL，10 g／L（NH4）2MoO4溶液1滴；混匀静置3min，用0.005mol／L Na2S2O3溶液滴定，达浅黄色时，加淀粉指示剂3滴，至蓝色消失，记录消耗的Na2S2O3溶液数。

1.2.4 统计学处理 原始数据通过SPSS11.0软件中的ANOVA程序处理。

2 结果

2.1 大体病理变化

染毒6d后，肉眼观察较高浓度染毒组（Cd2＋：0.5、5mg／L）泥鳅脊椎出现弯曲（图1），体表有红色出血点（图2）；解剖后发现，体腔内有大量的淡黄色液体渗出，肝（胰）脏和胆囊充盈肿大。

图1 脊椎弯曲、畸形Fig.1 Antisternum bend and malformaction

图2 体表出现血点Fig.2 Hemorrhage in body surface

2.2 肝脏病理组织学变化

泥鳅经不同浓度Cd2＋暴露染毒后，随着染毒时间的延长，较高浓度染毒组（0.5、5mg／L）与对照组相比，肝组织结构出现异常变化（图3，图4）。主要表现为肝细胞肿胀，出现破裂现象，肝索间隙增大，部分细胞内出现小空泡，呈蜂窝状，核被挤向一侧（图5）；肝细胞条索状消失，细胞内出现较大的空泡，核悬浮在细胞的中央，细胞破裂，胞质结构消失，细胞核出现浓缩、破裂、溶解，甚至消失（图6）。

2.3 过氧化氢酶活性的变化

随着镉染毒浓度的增加和同一浓度处理时间的延长，滴定所消耗的硫代硫酸钠量显著下降。染毒2d后，染毒组与对照组之间无显著差异（P＞0.05）；染毒4d后，0.05mg／L染毒组与对照组之间差异显著（P＜0.05），其余两染毒组与对照组相比差异极显著（P ＜0.01）；染毒6、8、10d后，染毒组与对照组之间相比都差异极显著（P＜0.01）（表1）。

图3 对照组肝细胞结构正常（HE400×）Fig.3 Normal hepatic cell structure in control group（400×）

图4 0.05mg／L染毒组肝索较明显，细胞结构较完整（HE400×）Fig.4 Hepatic cord is more obvious and cell structure is complete in contaminated group of 0.05mg／L（400×）

图5 0.5mg／L染毒组肝细胞弥散、破碎（HE400×）Fig.5 Hepatic cells are confused and broken in contaminated group of 0.5mg／L（400×）

图6 5mg／L染毒组肝细胞破裂，溶解（HE400×）Fig.6 Hepatic cells are ruptured and dissoved in contaminated group of 0.5mg／L（400×）

表1 镉对泥鳅过氧化氢酶活性的影响Table1 Effects of Cd2＋on liver catalase activity in loach

3 讨论

细胞内的镉能取代钙与肌动蛋白、微管、微丝相结合，从而破坏细胞骨架的完整，损害细胞的功能；镉还能破坏细胞之间的连接。镉与磷质（骨质磷酸钙）发生亲和反应，将骨质磷酸钙中的钙置换出来，使骨骼严重缺钙而变得疏松、软化，继而发生萎缩、变形和骨折等[10]。本次研究发现，镉染毒组（0.5 mg／L、5mg／L）泥鳅在染毒6d后脊椎出现了弯曲，说明是由于钙的严重缺失才导致脊椎的变形。体表的红色出血点，可能是由于水环境中的镉被鱼体吸收后进入血液循环系统，一方面改变血管的通透性，使血管壁损伤，引起出血，另一方面导致血红蛋白降解产生大量血源性色素（含铁血黄素）所致[11]。

在环境胁迫等逆境情况下，生物体内广泛存在活性氧曝发现象，导致自由基增多，使细胞膜产生过氧化，引起细胞膜的破坏和损伤。过氧化氢酶在清除超氧自由基、H2O2和过氧化物及阻止或减少羟基自由基形成等方面发挥重要作用[12]。本试验中，随着染毒浓度的增加和同一浓度处理时间的延长，硫代硫酸钠所消耗的量越来越少，表明肝组织中过氧化氢酶的催化能力越来越弱，即Cd2＋对过氧化氢酶的活性抑制作用越来越大。结合肝脏显微结构观察发现，当Cd2＋的染毒剂量达到0.5mg／L时泥鳅肝脏出现了损伤，浓度越大肝损伤越严重。

综上所述，泥鳅对Cd2＋反应较为灵敏，能反映水体中污染物的作用，是一种较有前途的生物检测指标和生物标志物。

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