猪源牛病毒性腹泻病毒SD0803株E2蛋白的表达及抗体制备

邓 宇，蔺 涛，孙春清，张宏彪，张 荣，龙进学，黄 律，文心田，曹三杰，童光志，袁世山，郑 浩＊

（1.四川农业大学动物医学院，四川 雅安 625014；2.中国农业科学院上海兽医研究所，上海 200241；3.西昌学院动物科学学院，四川 西昌 615000；4.南京农业大学动物医学院，江苏 南京 210095）

牛病毒性腹泻病毒（Bovine viral diarrhea virus，BVDV）是单股正链RNA病毒，属于黄病毒科（Flaviridea）瘟病毒属（Pestivirus）成员，当前被分为2个种，BVDV－1和 BVDV－2[1]。BVDV 基因组全长约为12.3kb～12.5kb，由一个大的开放阅读框（open reading frame，ORF）和5′与3′非翻译区（untranslated region，UTR）所组成。该病毒ORF编码约4000个氨基酸残基组成的多聚蛋白，在病毒非结构蛋白与宿主细胞信号肽酶作用下，加工成BVDV结构蛋白和非结构蛋白，依次为p20（Npro）、C，gp48（Erns）、gp25（E1）、gp53（E2）、p7、p125（NS2－3（NS2，NS3））、p10 （NS4A）、p30 （NS4B）、p58（NS5A）、p75（NS5B）[2－3]。其中，E2（gp53）是 BVDVs亚型分类的依据之一，也是主要保护性抗原[4－5]。BVDV除引起牛感染外，还能引起野生反刍动物、兔、绵羊、山羊、猪等动物感染。猪感染BVDV会出现类似猪瘟的临床症状与病理变化[6]，给养猪业带来危害。近3年来，流行病学调查结果表明，我国猪群中BVDV感染已经比较严重，送检的样品中，部分批次样品阳性率高达80.72%[7－9]。近4年来，我们实验室对来自我国11省份的猪病料样品进行BVDV检测，结果也发现，部分猪场BVDV感染很严重，高达79.3%。我们从这些阳性病料中分离鉴定出一株BVDV SD0803，基于此，我们根据此毒株E2基因表达蛋白免疫兔制备多克隆抗体，为猪源BVDV快速诊断提供一种参考方法，为猪源BVDV病原学研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 毒株、细胞、实验动物 猪源BVDV SD0803株由本实验室分离鉴定；BVDV NADL标准毒株，购自中国兽医药监察所；MDBK细胞，购自美国ATCC，经本实验室建立的Nested－PCR与直接免疫荧光（Direct FA）检测均为BVDV阴性；实验兔，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司。

1.1.2 主要试剂 马血清（经检测BVDV抗原抗体呈阴性），PBS购自 GIBCO公司；RPMI－1640培养基，购自Hyclone公司；FITC标记BVDVs抗体，购自美国 VMRD 公司；pGEX－4T－1、BL21、DH5α，购自康为世纪生物科技有限公司；EcoRⅠ和XhoⅠ，购自Thermo公司；QIAamp®Viral RNA Mini Kit，购自QIAGEN公司；AMV反转录酶、LA Taq聚合酶，购自宝生物工程（大连）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物设计及合成 根据GenBank中公布的多个BVDV－1毒株的全长序列进行比对，用Primer Premier 6.0设计2对特异引物扩增SD0803株E2基因，预期扩增约1400bp，引物序列分别为：F1975，5′－CCC（TC）GG（GT）A（AG）（GA）TT（TC）GACACCAATGC－3′；R4014，5′－CTGTC ACATA（GA）CTA A（CT）CATCAG－3′；F2249，5′－GACCA（AG）ATTGGTGGCCTT ATGAGAC；R3640，5′－A（CT）T（GA）T（CT）ATG（TG）GTTA（GA）CAAGTTGCC－3′。

根据上述引物扩增SD0803E2基因序列，采用DNA Star软件预测分析，选择表达蛋白抗原性、亲水性较好的序列设计合成一对引物，用于扩增表达蛋白的靶基因（sE2），预期扩增约735bp，其引物序列 为 E2－F：5′－AGCGAATTCTTTGA ACAACT CTTCAATGGG－3′；E2－R：5′－AGCCTCGAGTT AGTACTCCCCTTTTAA CATA－3′，其中，在上下游引物分别引入EcoRⅠ和XhoⅠ限制性酶切位点（下划线标识）和3个保护性碱基，引物均由Invitrogen（上海）公司合成。

1.2.2 E2基因PCR扩增 用 QIAamp®Viral RNA Mini Kit按照操作说明书提取SD0803株MDBK细胞培养上清RNA。以R4014为反转录引物，参照AMV反转录酶操作说明书，进行反转录，合成cDNA。然后分别以 F1975／R4014，F2249／R3640为引物进行 RT－PCR、Nested－PCR扩增，方法按LA Taq聚合酶说明书进行。RT－PCR扩增条件为：94℃预变性5min；94℃30s，55℃30s，72℃2min 35个循环；72℃延伸10min。套式PCR扩增条件为：94℃预变性5min；94℃30s，58℃30s，72℃1min 30s35个循环；72℃延伸10min。扩增结束后取5μL Nested－PCR反应产物，用10g／L琼脂糖凝胶电泳检测。用DNA胶回收试剂盒纯化Nested－PCR产物，直接送纯化产物至Invitrogen（上海）公司测序，分析测序结果，确定SD0803E2基因。

1.2.3 sE2基因PCR扩增 以Nested－PCR纯化产物为模板，以E2－F与E2－R为PCR扩增引物，按LA Taq聚合酶说明书进行PCR扩增，反应条件为：95℃预变性3min；95℃30s，58℃45s，72℃45s35个循环；72℃延伸5min。反应结束后取5μL PCR反应产物，用10g／L琼脂糖凝胶电泳，鉴定扩增产物的大小正确后DNA胶回收试剂盒回收、纯化。

1.2.4 重组表达载体pGEX－4T－1－sE2的构建 纯化产物（sE2）用限制性内切酶EcoRⅠ与XhoⅠ双酶切后与用相应限制性内切酶处理的pGEX－4T－1载体连接，22℃连接过夜。65℃灭活10min后，转化至DH5α感受态细胞，37℃生长过夜，随机挑取克隆，提取质粒，用EcoRⅠ与XhoⅠ对质粒双酶切，鉴定正确的重组质粒送Invitrogen（上海）公司测序。

1.2.5 SD0803sE2基因诱导表达及表达产物纯化将重组质粒pGEX－4T－1－sE2接种至3mL TB培养基（含氨苄抗性）中37℃培养箱中振荡培养过夜，次日取该菌液按1∶100的比例加入300mL LB培养基（含氨苄抗性）中，37℃振荡培养至OD600为0.5～0.6时，加入1.5mmol IPTG进行诱导表达。37℃诱导4h后收菌，表达产物采用文献[10]所述方法，进行纯化，获得的产物命名为rsE2。采用SDS－PAGE对纯化蛋白进行分析。

1.2.6 抗rsE2蛋白多克隆抗体的制备及纯化 首次免疫，取rsE2蛋白与等体积的弗氏完全佐剂充分乳化，500μg／只的剂量多点皮下接种兔。间隔3周后，用rsE2蛋白加等体积弗氏不完全佐剂充分乳化后，加强免疫3次，按250μg／只剂量皮下接种兔。末次免疫后1周，兔心脏采血，分离血清，制备抗体，置－20℃保存。

利用5mg rsE2蛋白制备抗原交联柱，抗血清经过5000r／min离心15min，滤纸过滤后，用10倍柱体积的1×PBS平衡交联柱，然后抗血清过柱两次，再用含1mol／L NaCl的PBS缓冲液清洗柱子，然后用100mmol／L的1×Glycine－HCl（pH2.3）洗脱抗体，收集洗脱抗体用Tris缓冲液平衡至中性。随后在1×PBS溶液中透析2h，再在含550mL／L甘油的PBS溶液中透析4h～8h，收取抗体，置－70℃保存备用。

1.2.7 多克隆抗体的鉴定

1.2.7.1 间接ELISA抗体效价的测定 参照文献[11]所建立间接ELISA方法，以SD0803MDBK细胞培养上清作为包被抗原建立间接ELISA，检测兔抗血清的抗体效价及特异性。

1.2.7.2 Western blot抗体特异性检测 将rsE2蛋白进行SDS－PAGE电泳，然后以湿转法将蛋白转到NC膜上面；经50g／L脱脂奶粉室温封闭2h后，用兔抗rsE2纯化抗体为一抗，FITC标记的羊抗兔IgG作为二抗，按文献[10]所述方法进行 Western blot分析。

1.2.8 BVDV 抗原的检测 将SD0803、NADL分别接种基本长满单层的6孔板MDBK细胞，3d后，用甲酮固定，所制备的多抗为一抗，FITC标记的羊抗兔IgG为二抗，做间接免疫荧光试验。

2 结果

2.1 SD0803E2及sE2基因扩增

采用套式PCR扩增SD0803的E2基因，经琼脂糖凝胶电泳鉴定，得到约1400bp条带，与预期大小一致（图1），送其产物测序，得到的序列为SD0803 E2基因序列。PCR扩增sE2基因，获得预期的735 bp条带（图2）。

图1 SD0803E2基因扩增Fig.1 Amplification of E2gene of SD0803

图2 SD0803sE2基因扩增Fig.2 Amplification of sE2gene of SD0803

2.2 重组表达载体pGEX－4T－1－sE2的构建

SD0803sE2基因与pGEX－4T－1构建重组表达载体，获得的阳性克隆送公司测序，测序结果表明，sE2基因插入的位置、大小均正确，证实重组质粒构建成功，命名为pGEX－4T－1－sE2。

2.3 SD0803sE2基因诱导表达及重组蛋白的鉴定

重组质粒pGEX－4T－1－sE2经诱导表达，获得的蛋白表达产物进行纯化，其中，上清Ⅰ为超声波破碎细胞，10000r／min离心10min后收集得到的上清液；加1×PBS重悬沉淀后，加入尿素，充分溶解沉淀，相同条件超声波破碎细胞，10000r／min离心10 min后收集的上清液，此上清为上清Ⅱ。用SDSPAGE电泳分析，获得分子质量约为52ku诱导表达产物，与预期大小一致（图3）。

图3 SD0803sE2基因表达产物SDS－PAGE分析Fig.3 Analysis SDS－PAGE of expression product of SD0803sE2gene

2.4 抗rsE2蛋白多克隆抗体的制备

采用建立的间接ELISA，测定末次免疫1周后分离的抗血清，其抗体效价可达1∶256000，表明制备的抗体有较高的效价。

2.5 抗体特异性鉴定

2.5.1 Western blot分析 Western blot发现，一抗（抗血清纯化获得的抗体）1∶1000稀释，亦能出现约52ku特异性条带（图4），结果表明，制备的多抗具有良好的特异性与较高的效价。

图4 抗体Western blot分析Fig.4 Analysis of antibody by Western blot

2.5.2 BVDV抗原检测 间接免疫荧光试验结果，SD0803株、NADL标准株感染的MDBK细胞内出现特异性绿色荧光，结果表明，多克隆抗体分别能特异结合MDBK后分泌产生的E2蛋白（图5）。

图5 BVDV E2蛋白在MDBK细胞中表达的免疫荧光检测Fig.5 Detection of BVDV E2protein expressed in MDBK with immunofluorescence assay

3 讨论

BVDV E2是病毒的主要保护性抗原，其编码的蛋白gp53是囊膜糖蛋白，受糖基化的影响，分子质量为51ku～58ku之间，介导免疫中和反应、决定BVDV抗原性及其抗体、宿主细胞识别、吸附的主要部位[12－14]。gp53具有中和作用，其N端有2个抗原域（antigenic domain），一个是种内保守的主要抗原域，另一个是不同毒株之间的特异性抗原域；其C端存在YYEP线性表位，在猪瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）、边界病毒（Border disease virus，BDV）及BVDV这3种病毒内具有高度保守性，这一蛋白可作为特异性诊断工具[15]。最新试验证实，BVDV Manasi株 E2pET－（144～340）、pET－（1～300）诱导表达的融合蛋白均能被BVDV阳性血清识别[16]。通过去除BVDV Changchun184E2基因3′端编码的gp53蛋白跨膜疏水区序列，可以使该蛋白在大肠埃希菌中高效表达[17]。鉴于上述研究结果，本试验选取gp53蛋白56～324区段（sE2）表达的蛋白免疫兔，结果表明，获得的抗体能被SD0803、BVDV标准毒株NADL识别，这一结果证实所制备的抗体具有良好特异性和较高的效价。

构建的表达载体采用不同浓度的IPTG、不同诱导时间，结果发现，在37℃条件下，加1.5 mmol／L IPTG诱导4h，表达的蛋白量最多。诱导表达的蛋白经SDS－PAGE分析，发现以包涵体形式存在。由于包涵体除了含目的蛋白之外，还包含有其他成分比如细菌膜蛋白、肽聚糖、脂多糖及脂质等。一般情况下，在包涵体溶解之前可用低浓度的尿素做变性处理，溶解包涵体，可以除去大部分杂质。所以本试验中，将获得的包涵体用尿素法进行2次洗涤，以去除杂质，然后利用GST蛋白标签柱层析法纯化包涵体，从SDS－PAGE电泳结果来看，过柱纯化后包涵体蛋白杂质明显减少，rsE2蛋白纯化是成功的。

获得的抗血清，在检测其抗体效价时，为了避免非特异性反应，准确测定抗血清效价，我们选用BVDV SD0803MDBK细胞培养上清作为检测抗原包板进行间接ELISA。经检测，获得高达1∶256000效价的抗血清。在多克隆抗体鉴定方面，采用3种方法，即间接ELISA、Western blot、免疫荧光法对多克隆抗体进行鉴定，结果证实制备的多克隆抗体具有良好的反应性和特异性，为下一步建立猪源BVDV特异性诊断方法奠定了基础。

[1]Fauquet C.Virus taxonomy：classification and nomenclature of viruses：eighth report of the International Committee on the Taxonomy of Viruses[M].Academic Press，2005.

[2]Tautz N，Kaiser A，Thiel H J.NS3serine protease of bovine viral diarrhea virus：characterization of active site residues，NS4Acofactor domain，and protease－cofactor interactions[J].Virology，2000，273（2）：351－363.

[3]Liu L，Xia H，Wahlberg N，et al.Phylogeny，classification and evolutionary insights into pestiviruses[J].Virology，2009，385（2）：351－357.

[4]Becher P，Orlich M，Shannon A，et al.Phylogenetic analysis of pestiviruses from domestic and wild ruminants[J].J Gene Virol，1997，78（6）：1357.

[5]Becher P，Orlich M，Kosmidou A，et al.Genetic diversity of pestiviruses：identification of novel groups and implications for classification[J].Virology，1999，262（1）：64－71.

[6]Xu X，Zhang Q Y，Liang X，et al.Sequencing and comparative analysis of a pig bovine viral diarrhea virus genome[J].Virus Res，2006，122（2006）：164－170.

[7]卫秀余，沈 强，余红梅.2009年猪病诊断回顾[J].今日养猪业，2010（1）：34－35.

[8]宋永峰，张 志，张燕霞，等.猪源牛病毒性腹泻病毒的流行初探[J].中国动物检疫，2008（7）：25－27.

[9]吴文辉，卫秀余，余红梅，等.猪群BVDV感染状况调查及成因初步分析[J].上海畜牧兽医通讯，2011（4）：35－37.

[10]奥斯帕F M，金斯顿R E.精编分子生物学实验指南[M].4版.北京：科学出版社，2005.

[11]郑其升，杨耀武，周 斌，等.流行性乙型脑炎病毒E蛋白主要抗原域的原核表达与间接ELISA检测方法的初步建立[J].中国病毒学，2004，19（5）：458－461.

[12]Harada T，Tautz N，Thiel H J.E2－p7region of the bovine viral diarrhea virus polyprotein：processing and functional studies[J].J Virol，2000，74（20）：9498.

[13]Tscherne D M，Evans M J，Macdonald M R，et al.Transdominant inhibition of bovine viral diarrhea virus entry[J].J Virol，2008，82（5）：2427.

[14]Harpin S，Hurley D J，Mbikay M，et al.Vaccination of cattlewith a DNA plasmid encoding the bovine viral diarrhoea virus major glycoprotein E2[J].J Gen Virol，1999，80（12）：3137.

[15]Yu M，Wang L F，Shiell B J，et al.Fine mapping of a C－terminal linear epitope highly conserved among the major envelope glycoprotein E2（gp51to gp54）of different pestiviruses[J].Virology，1996，222（1）：289－292.

[16]黄 新，王新华，钟发刚.牛病毒性腹泻病毒玛纳斯株E2基因的克隆及其主要抗原表位区的分段表达[J].中国兽医科学，2009（4）：321－326.

[17]徐兴然.牛病毒性腹泻病病毒中国毒株E2基因的鉴定及表达E2蛋白的抗原性研究[D].吉林长春：中国人民解放军军需大学，2002.