益气养阴消癥通络方对糖尿病肾病大鼠血管内皮生长因子信号通路的影响

郭立芳 王凤丽 王月华 丁英钧 陈志强

(河北省中医院，河北 石家庄 050011)

糖尿病肾病(DN)是个渐进性的肾脏疾病且代表了糖尿病严重的晚期并发症，目前仍缺乏有效的治疗手段。我们以“久病入络”理论为指导，提出气阴两虚、癥积络阻为DN基本病机，以益气养阴消癥通络为DN的治疗大法。而前期研究中我们已经证实该法能够通过对DN大鼠TGF-β/Smads、氧化应激及RAS系统的影响发挥对DN的治疗作用〔1～6〕。现代研究表明，足细胞及其裂孔隔膜上的裂孔膜蛋白与蛋白尿的发生密切相关，而血管内皮生长因子(VEGF)能增加肾小球滤过屏障对血浆蛋白的通透性，其过表达参与了DN蛋白尿的发生。因此本研究继以DN动物模型，观察益气养阴消癥通络法对DN大鼠VEGF信号转导通路的影响，为中药复方制剂延缓DN提供现代医学理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 本实验研究选用雄性SD大鼠70只，清洁级，体质量为(200±10)g，由河北医科大学动物中心提供，合格证号:703058。

1.2 实验药物 益气养阴消癥通络中药，由黄芪、玄参、地龙、鳖甲、丹参、大黄、乌梢蛇、水蛭、全虫等组成，经粉碎、水煎浓缩至含生药3 g/ml(河北医科大学中医院制剂室提供)。厄贝沙坦组予大鼠厄贝沙坦片(批号为0809155，由杭州赛诺菲圣德拉堡民生制药有限公司生产)15 mg·kg-1·d-1。

1.3 方法

1.3.1 动物的分组及造模 选用雄性SD大鼠70只，适应性饲养1 w后，分别置代谢笼里取尿，测定尿蛋白及尿红细胞全部阴性，60只大鼠均行腹腔注射STZ(55 mg·kg-1·d-1)一次，3 d后测空腹血糖≥16.7 mmol/L随机分为模型组、中药组及厄贝沙坦组，开始灌胃给药。分别于实验第4、8、12、16、20、24周于代谢笼里留取24 h尿量后，股动脉取血并取右侧肾组织待测。

1.3.2 免疫组化方法检测VEGF、Flt1的表达情况 脱水后常规石蜡包埋，制成蜡块，切成5μm厚的连续切片，附于经多聚赖氨酸附膜的载玻片上。按照SP免疫组化染色试剂盒要求操作。半定量分析:采用多功能真彩色细胞图像分析管理系统，进行400倍的显微照相，每张切片镜下随机选取5个视野，在光亮度和放大倍数一致的条件下观察肾脏阳性产物的分布、染色情况。

1.3.3 Western印迹方法检测VEGF、Flt1的表达情况 用RIPA蛋白裂解液提取肾组织总蛋白，采用Bradford法测定蛋白浓度;取肾组织裂解蛋白50μg，经15%SDS-PAGE垂直凝胶电泳后，电转移至PVDF膜;5%脱脂奶粉室温封闭1 h;加一抗，4℃过夜，加二抗，室温2 h，以上两步后TBST洗膜10 min×3次;DAB显色;Gene图像分析仪摄像、分析，目的蛋白相对含量以目的蛋白/β-actin(内参)的灰度比值表示。

1.4 统计学方法 采用SPSS13.0统计软件包进行统计分析，采用单因素方差分析，组间两两显著性比较采用最小显著差异(LSD)法。

2 结果

2.1 免疫组化方法检测VEGF、Flt1的表达 VEGF主要表达于肾小球脏层上皮细胞，Flt1则主要表达于肾小球内皮细胞，在肾小球壁层上皮细胞也有部分表达。半定量分析显示，模型组及两治疗组较正常组VEGF及Flt1的表达显著升高(P＜0.01);厄贝沙坦组、中药组与模型组相比，VEGF及Flt1的表达均显著下降(P＜0.05);厄贝沙坦组与中药组比较无明显差异(P＞0.05)。见表1。

2.2 Western印迹方法检测VEGF、Flt1的表达 与正常组比较，模型组及两治疗组 VEGF及Flt1的表达显著升高(P＜0.01);与模型组比较，厄贝沙坦组及中药组VEGF和Flt1的表达均显著下降(P＜0.01);厄贝沙坦组与中药组比较无显著性差异(P＞0.05)。见表2。

表1 各组大鼠VEGF和Flt1蛋白表达半定量分析结果(x±s)

表2 各组大鼠VEGF和Flt1相对蛋白含量比较(x±s)

3 讨论

我们认为DN的基本病机是气虚无力运血而致血瘀;阴虚火旺，煎熬津液，津亏液少则血液黏稠不畅而致“阴虚血瘀”，病久不愈深伏于肾络渐成微小癥积，致使肾体受损，肾用失司，导致DN的发生。据此，我们结合“病久必瘀、病久入络”的中医病理学理论，提出该病证病位在络，“瘀血癥积阻于肾络”可能是病机之关键，就在益气养阴基础上加水蛭、乌梢蛇、全蝎等化瘀消癥通络虫类药物进行干预，并对该方治疗DN进行了较为系统的临床疗效观察，同时又进行了其对TGF-β/Smads、氧化应激及RAS系统等有关作用机制的基础研究，均取得了满意的治疗效果〔1～6〕，进一步证实“瘀血癥积阻络证”几乎贯穿DN全过程。

既往研究认为，DN的主要病理特征是肾小球细胞外基质堆积、系膜增宽、基底膜增厚，肾小球硬化及肾间质纤维化。然而，这些因素仅能解释30%～50%的尿蛋白排泄率和肾小球滤过率的变化〔7〕，而足细胞损伤则导致肾小球滤过膜完整性丧失和大量蛋白漏出〔8〕。足细胞足突间的裂孔隔膜的完整性是决定肾小球滤过屏障通透性的关键，而裂孔隔膜上的裂孔膜蛋白与蛋白尿的发生密切相关〔9〕。另外研究中发现，VEGF是迄今所发现最强大的血管通透因子，能增加肾小球滤过屏障对血浆蛋白的通透性。VEGF在肾脏组织中含量丰富，主要由肾小球足细胞合成分泌。糖尿病足细胞上VEGF过表达参与了尿蛋白的发生。研究也发现，高糖能通过如TGF-β、氧化应激等多种因素诱导足细胞VEGF表达上调，VEGF还能通过VEGF受体1(Flt1)信号通路，刺激足细胞产生GBM的主要成分，即Ⅳ型胶原 α3 链〔10～12〕。Wolf等〔13〕研究表明，血管紧张素Ⅱ可以刺激足细胞产生VEGF，随后引起nephrin表达的减少和蛋白尿的形成。另在DN小鼠模型中发现，肾小球内VEGF表达明显增加、上皮细胞足突裂孔的密度下降，阻断VEGF信号可部分恢复足突裂孔密度、防止肾小球基底膜增厚、减轻尿蛋白〔14〕。以上结果证明，VEGF自我调节体系在调节足细胞GBM成分中发挥重要作用。

本研究结果表明，益气养阴消癥通络法能够通过对VEGF信号转导通路的影响，发挥其延缓DN进程的作用。结合我们以前的研究成果，综合分析益气养阴消癥通络法具有特定的多途径、多靶点防治DN的细胞及分子调控机制。

1 王月华，陈志强，郭登洲，等.益气养阴消癥通络中药对糖尿病肾病大鼠TGF-β/Smads信号传导系统的影响〔J〕.中草药，2009;40(4):27-30.

2 王月华，郭登洲，王彦凯，等.活血化瘀消癥通络中药对糖尿病肾病的干预作用〔J〕.中国中西医结合肾病杂志，2009;10(4):345-7.

3 郭登洲，王月华，张芬芳，等.活血化瘀消癥通络中药治疗糖尿病肾病76例临床研究〔J〕.中国全科医学，2007;10(20):1692-3.

4 郭登洲，王月华，边 东，等.活血化瘀消癥通络中药治疗糖尿病肾病大鼠血管紧张素系统的影响〔J〕.中医杂志，2010;51(1):75-8.

5 赵雯红，陈志强，张江华，等.益气养阴消癥通络中药对早期糖尿病大鼠肾组织p38 MAPK信号通路的影响〔J〕.中国中药杂志，2010;35(6):768-71.

6 张江华，陈志强，孙玉凤，等.益气养阴、消癥通络中药对早期糖尿病大鼠肾组织Nephrin基因表达的影响〔J〕.北京中医药大学学报，2010;33(2):113-6，140.

7 Dalla Vestra M，Masiero A，Roiter AM，et al.Is podocyte injury relevant diabetic nephropathy?Studies in patients with type2 diabetes〔J〕.Diabetes，2003;52(4):1031-5.

8 White KE，Bilous RW，Diabiopsies Study Group.Structural interactions to the podocyte rerealated to protein uria in type 2 diabetic patients〔J〕.Nephrol Dial Trans Plant，2004;19(6):1437-40.

9 Pavenstadt H，Kriz W，Kretzler M.Cell biology of the glomerular podocyte〔J〕.Physiol Rev，2003;83(1):253-307.

10 Chen S，Kasama Y，Lee JS，et al.Podocyte-derived vascular endothelial growth factor mediates the stimulation of 3(Ⅳ)collagen production by transforming growth factor-1 in mouse podocytes〔J〕.Diabetes，2004;53(11):2939-49.

11 陈泽君，黄颂敏，杨亦彬，等.糖尿病鼠肾小管周围新生血管与促血管生长因子关系研究〔J〕.中国实用内科杂志，2006;26(15):1173-5.

12 Kang YS，Park YG，Kim BK，et al.Angiotensin Ⅱ stimulates the synthesis of vascular endothelial growth factor through the p38 mitogen activated protein kinase pathway in cultured mouse podocytes〔J〕.J Mol Endocrinol，2006;36(2):377-88.

13 Wolf G，Ziyadeh FN.Cellular and molecular mechanisms of protein uria in diabetic nephropathy〔J〕.Nephron Physiol，2007;106(2):26231.

14 Sung SH，Ziyadeh FN，Wang A，et al.Blockade of vascular endothelial growth factor signaling ameliorates diabetic albuminuria in mice〔J〕.J Am Soc Nephrol，2006;17(11):3093-104.