肌肽对过氧化氢诱导PC12细胞损伤后NF-κB P65表达的影响

董晓丽 明海霞 金 戈

(甘肃中医学院生理学教研室，兰州 甘肃 730000)

肌肽是继超氧化物歧化酶(SOD)和维生素E后又一被发现的天然非酶促自由基清除剂和抗氧化剂〔1〕。本研究用H2O2处理PC12细胞，制备氧化应激损伤致凋亡的模型，采用MTT法检测肌肽对PC12细胞增殖的影响，观察肌肽是否具有抗氧化应激的神经保护作用;检测肌肽对凋亡相关基因NF-κB P65 mRNA和蛋白表达的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 大鼠肾上嗜铬细胞瘤细胞(PC12细胞)购于上海中科院生物细胞所;引物设计参考文献〔2〕，委托上海生工合成。L-肌肽购自吉尔生化(上海)有限公司、UNIQ-10 Trizol总RNA抽提试剂盒和AMV一步法RT-PCR试剂盒购自上海生工生物工程技术服务有限公司;小鼠抗大鼠NF-κB P65单克隆抗体、SABC、DAB试剂盒等购自武汉博士德生物工程公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 PC12细胞经常规传代培养，培养基采用DMEM培养液，含10%热灭活超级新生牛血清、1%谷氨酰胺、青链霉素(100 U/ml)。37℃、5%CO2，饱和湿度下恒温培养箱中贴壁生长，每3天换液1次，1 w传代1次。

1.2.2 MTT比色法检测PC12细胞的增殖 取对数生长期的PC12细胞，制成单细胞悬液，按照1×104个/ml的密度接种于96孔板中，每组6孔，37℃孵育过夜后，弃去原培养液，正常组加入 DMEM完全培养基 100μl，损伤组加入终浓度为200μmol/L的H2O2，保护组加入H2O2前30 min加入肌肽，使肌肽终浓度分别为10，20，30 mmol/L。37℃孵育16 h，弃去药液和培养液，每孔加入MTT 25μl，继续孵育4 h，小心吸去上清液，每孔加入二甲基亚砜(DMSO)150μl，振荡10 min，用酶联免疫分析仪490 nm波长检测各孔光密度(OD)值，并计算生长抑制率。根据实验结果选择肌肽作用PC12细胞的最佳浓度。

1.2.3 RT-PCR检测NF-κB P65 mRNA的表达 将所需离心管、PCR反应管和微量吸头在0.1%EPC溶液中浸泡24 h，烤干后高压灭菌备用。RNA抽提按照UN IQ210 Trizol总RNA抽提试剂盒说明书进行。RT-PCR引物设计参照文献〔2〕:扩增产物扩增产物493 bp。RT-PCR反应按试剂盒说明操作。扩增产物保存于4℃冰箱，取扩增产物于2%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.4 SABC免疫酶染色法测定NF-κB P65蛋白的表达 取对数生长期细胞制成单细胞悬液，接种于预先放置6 mm×22 mm盖玻片的六孔板中，培养过夜。弃原培养液，设正常对照组、损伤组(加入终浓度为200μmol/L的H2O2)、保护组(加入H2O2前30 min加入肌肽终浓度为20 mmol/L)和空白对照组，继续培养16 h，取出盖玻片，按照SABC试剂盒说明书操作。

1.2.5 Annexin V2FITC和PI双染流式细胞仪检测细胞凋亡调整细胞计数为1×106个/ml接种于T250培养瓶中，设正常对照组、损伤组、保护组(加入H2O2前30 min加入肌肽终浓度为20 mmol/L)和空白对照组，培养24 h，弃液，加入DMEM继续培养16 h，用PBS重悬细胞，离心5 min，弃上清，重复2次，将细胞重悬于200μl结合缓冲液。加入10μl Annexin V2FITC和5μl PI，轻轻混匀，避光室温反应15 min，加入300μl结合缓冲液，立即上机检测。记录激发光波波长为488 nm处的荧光。

1.3 统计学处理 数据均用x±s表示，采用SPSS10.0软件包处理，根据方差齐性检验结果，两组间比较采用独立样本t检验或Mann-Whitney U检验。多组间比较采用单因素方差分析或Kruskal-Wallis H检验。

2 结果

2.1 肌肽对过氧化氢的毒性有保护作用 培养的PC12细胞用不同的剂量(10～30 mmol/L)的肌肽预处理30 min，加入200μmol/L的H2O2，PC12细胞的存活率随肌肽剂量的增大而升高，具有明显的量效依赖性。20 mmol/L达最大值。见表1。

2.2 肌肽对NF-κB P65基因mRNA表达的影响 RT-PCR结果显示，用20 mmol/L的肌肽预处理PC12细胞，再用H2O2处理细胞后，NF-κB P65 PCR产物的条带变淡，说明肌肽作用于PC12细胞后，其NF-κB P65基因mRNA的表达下降。

2.3 肌肽对NF-κB P65蛋白的表达的影响 免疫组化SABC法表明肌肽可降低由H2O2导致的NF-κB P65蛋白表达。保护组NF-κB P65蛋白表达为26.3%，较损伤组(39.1%)明显降低(P＜0.05)，与正常组(11.8%)比较(P＜0.01)，阳性细胞数增多，阳性着色加深，或见颗粒样物质。

表1 L-肌肽对H 2 O2抑制PC12细胞增殖的影响(x ± s，n=6)

3 讨论

近年研究表明活性氧和氧化应激在神经退行性疾病的发病中起着重要的作用〔3〕。神经组织中含有大量易被氧化的不饱和脂肪酸以及低水平的抗氧化物质，使其更易受到活性氧的损伤〔4〕。H2O2是一种活性氧成分，它参与了许多神经系统疾病的发病机制。常用作神经细胞氧化损伤的诱导剂。PC12细胞在神经生长因子的作用下能够分化获得神经细胞表现型，具有神经细胞的一般生物学特征，能稳定传代，可以作为神经细胞的体外模型。H2O2可以诱导PC12细胞损伤凋亡〔5〕，其机制包括诱导凋亡相关基因Caspase-3和NF-κB P65的表达和胱天蛋白酶Caspase的活化等〔6〕。目前，肌肽已作为抗衰老、抗白内障药物应用于临床。最近，又有学者提出了肌肽有抗凋亡的作用〔7〕。氧化应激导致的神经细胞凋亡又是AD的重要机制之一，肌肽的神经保护是否与抗凋亡有关呢?这正是本实验的立题依据所在。NF-κB是一种具有多向转录调节作用的蛋白质，它分布广泛并调节多种基因的转录调控，参与炎症反应、免疫应答以及细胞的增生、转化和凋亡等重要的生理病理过程。曲喜英等〔6〕H2O2诱导PC12细胞凋亡结果也表明，H2O2浓度增大NF-κB P65mRNA及蛋白表达水平增加。Boehrer等〔8〕研究证实Aβ可激活培养神经元内NF-κB的表达，认为NF-κB在AD发病机制中起重要作用。Del Rio等〔9〕用多巴胺诱导神经细胞凋亡中发现NF-κB、P53和c-lun转录因子都被激活。本研究证实肌肽具有神经保护作用。有研究表明，NF-κB P65激活可以使细胞编码的抗凋亡蛋白迅速下降，包括Bcl-2、钙结合蛋白及凋亡蛋白的抑制因子;促凋亡蛋白上升，如P53、Par-4等。本研究结果表明NF-κB P65可能参与了H2O2诱导细胞凋亡的过程，肌肽能抑制PC12细胞的凋亡，机制可能是通过抑制NF-κB P65基因的表达来实现的。

1 唐寒芬，何明大.老年性痴呆的中西医研究进展〔J〕.中西医结合心脑血管病杂志，2011;9(3):362-4.

2 Samali A，Nordgren H，Orrenius S，et al.A comparative study of apoptosis and necrosis in HepG2 cell:oxidant-induced caspase inactivation leads to necrosis〔J〕.Biochem Biophys Res Commun，1999;255(1):6-11.

3 Emerit J，Edeas M，Bricaire F.Neurodegenerative diseases and oxidative stress〔J〕.Biomed Pharmacother，2004;58(1):39-46.

4 Tuppo EE，Forman U.Free radical oxidative damage and Alzheimer's disease〔J〕.J Am Osteopath Assoc，2001;101(1):11-5.

5 Jang JH，Surh YJ.Protective effect of resveratrol on by-drogen peroxide induced apo ptosis in rat pheochromocytoma(PCl2)genes〔J〕.Mutat Res，2001;496(1):181-90.

6 曲喜英，张海风，祝其峰.H2O2对 PC12细胞 Caspase-3和 NF-κB P65基因表达的影响〔J〕.武汉大学学报，2005;26(1):17-20.

7 Rinat Tabakman，Hao Jiang，Robert A，et al.Apoptotic characteristics of cell death and the neuroprotective effect of Homocarnosine on pheochromocytoma PC12 cells exposed to ischemia〔J〕.JNeurosci Res，2004;75:499-507.

8 Boehrer S，Chow KU，Beske F，et al.In lymphatic cells par-4 sensitizes to apoptosis by down regulating bcl-2 and promoting disruption of mitochondrial membrane potential and caspase activation〔J〕.Cancer Res，2002;62(6):1768.

9 Del Rio MJ，Velez Pardo C.Monoamine neurotoxins-in-duced apoptosis in lymphocytes by a common oxidative stress mechanism:involvement of hydrogen peroxide(H2O2)，caspase-3，snd nuclear factor kappa-B(NF-kappaB)，P53，c-Jun transcription factors〔J〕.Biochem Pharmacol，2001;63(4):677.