大肠菌群检查用培养基灵敏度的探讨

吴晓玲，廖燕萍，朱 铮

笔者发现，在药品大肠菌群检查方法的验证试验中，按2010年版《中国药典(一部)》以24 h产酸产气特征作为判断依据，某些中成药制剂若含有较弱的抑菌成分(抑菌性较强应改变检验方法)，胆盐乳糖发酵培养基管的产气就难以观察，但培养48 h后，产气明显，利于观察。因此，笔者收集了几种抑菌较弱和无抑菌作用的中药制剂，通过乳糖胆盐发酵培养基、胆盐乳糖发酵培养基、月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤、borth medium E 4种培养基进行比较试验。其中，乳糖胆盐发酵培养基是 GB/T 4789.5－003及2010年版《中国药典》中收载的大肠菌群检查法使用的培养基，胆盐乳糖发酵培养是2005年版《中国药典》中大肠菌群检查法使用的培养基，月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤是GB/T 4789.5－2011大肠菌群检查使用的培养基，borth medium E为德国默克公司生产的进口培养基。以上试验都通过24，48 h培养后观察其结果，以探讨大肠菌群检查用培养基的灵敏度。

1 仪器与材料

PYX－DHS型60×75培养箱(上海跃进医疗器械厂);BSC－1100IBS2型生物安全柜(北京东联哈尔仪器制造有限公司)。胆盐乳糖发酵培养基(上海中科昆虫生物技术开发有限公司，批号为080604);乳糖胆盐发酵培养基(上海中科昆虫生物技术开发有限公司，批号为070830);月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤(上海中科昆虫生物技术开发有限公司，批号为080521);borth medium E(德国Merck公司);0.9%无菌氯化钠溶液(自制);pH=7.0无菌氯化钠－蛋白胨水缓冲液(北京三药有限公司)。香连丸(厦门中药厂，批号为080403);萸连片(福建省安溪制药有限公司，批号为20090101);银蜜片(三明市三真药业有限公司，批号为20070704);大七厘散(厦门中药厂，批号为080303)。大肠埃希菌[CMCC(B)44102]购自中国药品生物制品检定所。

2 方法与结果

2.1 试验组

按2010年版《中国药典(一部)》中大肠菌群检查法[2]，取1∶10的供试液1 mL，分别加入到装有胆盐乳糖发酵培养基、乳糖胆盐发酵培养基、月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤、borth medium E培养基各10 mL的管中加有小倒管，每种培养基接种6支，分3组，每组2支，分别加入含10～20个 /mL、40～60个/mL、80～100个 /mL的大肠埃希菌1 mL(以计数为准)。

2.2 试验菌阳性对照组

同2.1项下方法操作，每种培养基接种6支，分3组，每组2支，不加供试液，分别加入含 10～20个/mL，40～60个/mL，80～100个/mL的大肠埃希菌1 mL(以计数为准)，作为试验菌阳性对照组。

2.3 供试品对照组

同2.1项下方法操作，每种培养基接种6支，分3组，每组2支，不加试验菌，分别加入1∶10的供试液1 mL，作为供试品对照组。将各接种后的培养基管置35～37℃环境培养18，24，48 h，观察各培养基产酸产气的情况。

2.4 试验结果

4种培养基加入样品及大肠埃希菌液，在不同的培养时间点观察细菌生长情况。大肠埃希菌在胆盐乳糖发酵培养基管、乳糖胆盐发酵培养基管中呈产酸产气现象;由于月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤、borth medium E培养基中未加入指示剂，因此大肠埃希菌加入后不变色，只有产气现象。每种样品均试验3次，在24 h内3次结果可能不同，以“/”表示，试验结果见表1。

表1 4种培养基大肠埃希菌生长情况

3 讨论

在药品的大肠菌群检查中，药品本身成分的抑菌性、对照菌液的浓度、敏感性、试验中试管中的沉淀物及培养基灵敏度等因素均能影响检验结果[1]，本试验仅采用不同种培养基，不改变其他试验条件，比较培养基的灵敏度。

从试验结果可见，不含抑菌成分的中成药(银蜜片、大七厘散)加菌培养24 h后，月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤、borth medium E产气，胆盐乳糖发酵培养基、乳糖胆盐发酵培养基均产酸产气。含较弱抑菌成分的中成药(香连丸、萸连片)加菌培养18 h，borth medium E全部产气，培养28 h后月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤产气，40 h后乳糖胆盐发酵培养基产酸产气，48 h后胆盐乳糖发酵培养基产酸产气。

4种不同的培养基比较，borth medium E灵敏度最高，月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤、乳糖胆盐发酵培养基次之，胆盐乳糖发酵培养基灵敏度最低。

从表1可见，加入到供试液内的大肠埃希菌分别为10～20个/mL，40～60个/mL，80～100个/mL时，产酸产气或产气的差别不显著，即在2010年版《中国药典(一部)》控制菌规定的10～100个/mL范围内，已可保证检出率。

试验发现，由于中成药供试液中多含有药渣等沉淀物，加入试验菌培养24 h后，小倒管口被沉淀物堵塞，有的样品小倒管内无小气泡，只有液面上有小气泡产生，轻轻拍打试管壁有小气泡上浮至液面，有的样品小倒管内及液面均无小气泡或气泡难以观察，但培养48 h后，液面上均有大量气泡，小倒管内或多或少有气泡填充，有弱抑菌作用的样品产气差异尤为明显。因此，48 h培养较24 h培养产酸产气更为明显，有利于观察。此现象说明，样品本身的作用使加入的试验菌受到抑制，培养48 h后菌细胞可得到修复并生长繁殖。因此，培养时间对药品检验结果的可靠性非常重要。

综上所述，2010年版《中国药典(一部)》大肠菌群检查法采用乳糖胆盐发酵培养基较合适，月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤亦可，建议大肠菌群检查培养时间由24 h延长至48 h，以利于细菌的检出。

[1]赵 勤.提高药品中大肠菌群检出率的初步探讨[J].苏州大学学报(医学版)，2005，25(6):1 009 － 1 012.

[2]国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[M].北京:化学工业出版社，2005:附录ⅩⅢC.