高效液相色谱法测定祖师麻叶中祖师麻甲素含量＊

汤迎爽，康阿龙

祖师麻(Cortex Daphnes)为瑞香科植物黄瑞香 Daphnegiraldii Nitsche、陕甘瑞香 Daphne tangutica Maxim.和凹叶瑞香 Daphne retusa Hemsl.的干燥根皮与茎皮，始载于《陕西中草药》，味辛、苦，性温，有小毒，归肝经，具祛风除湿、活血止痛功能，用于风湿痹痛、关节疼痛、跌打损伤、关节炎、类风湿性关节炎[1]，临床疗效显著。由其开发的制剂有祖师麻片、祖师麻注射液、黄瑞香注射液、祖师麻膏药、祖师麻关节止痛膏等，临床和制剂使用量很大，但由于其药用部位为皮部，采收方式几乎是毁灭性的，对主产地植被造成严重破坏，林区也大都实行了自然保护，限制采挖。为寻找其替代物，笔者在调查中发现，采收加工过程后白白浪费的叶子，在对其进行成分预试后发现含有香豆素类成分。祖师麻药材(根皮和茎皮)起主要药效作用的成分祖师麻甲素[2－3]，对其皮部含量进行测定的文献已有较多报道[4－6]，但未见有对其叶子中含量进行分析研究。为了给祖师麻叶的开发利用提供依据，笔者建立了测定其含量的高效液相色谱法，现报道如下。

1 仪器与试药

美国热电P4000型高效液相色谱仪，UV1000检测器，SEPU3000数据工作站(杭州普惠)。祖师麻甲素对照品(中国药品生物制品检定所，批号为0900－200001，供含量测定用);3批祖师麻叶及皮(自采)，均经西安市药品检验所谢志明主任药师鉴定，为黄瑞香 Daphnegiraldii Nitsche的叶与皮;甲醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱:DiamonsiLTMC18柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm);流动相:甲醇 －0.5%磷酸(20∶80);检测波长:327 nm;柱温:室温;流速:1 mL/min;进样量:10μL。对照品及祖师麻叶和祖师麻皮部色谱图见图1。

2.2 溶液制备

精密称取祖师麻甲素对照品 2.04 mg，置 10 mL 量瓶中，加85%乙醇使溶解，即得对照品溶液。分别取样品粗粉约10 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入85%乙醇20 mL，浸渍过夜，将其另装入适宜的渗漉筒中，再加入85%乙醇80 mL，以1 mL/(cm2·min)滴速进行渗漉，收集渗漉液，用85%乙醇定容至100 mL摇匀，滤过，再精密度该溶液1 mL，继用85%乙醇稀释并定容至25 mL，摇匀，滤过，制得供试品溶液。

2.3 方法学考察

线性关系考察:精密称取祖师麻甲素对照品5.10mg，置100mL量瓶中，加 85% 乙醇至刻度，摇匀，分别精密吸取 2，4，6，8，10 μL，注入液相色谱仪，记录色谱图，测定峰面积，并以峰面积对进样量进行回归，得回归方程 Y=75 021X+12 995，r=0.999 9。结果表明，祖师麻甲素进样量在0.102～0.510μg范围内与峰面积值呈良好的线性关系。

精密度试验:精密吸取同一对照品溶液10μL，重复进样6次，依法测定。结果的 RSD为0.82%(n=6)，说明仪器精密度良好。

图1 高效液相色谱图

稳定性试验:取同一祖师麻叶供试品溶液，分别放置0，2，4，6，8 h，各精密吸取10μL，注入液相色谱仪测定。结果祖师麻甲素含量的 RSD为1.26%(n=5)，表明供试品溶液在8h内稳定性良好。

重复性试验:取同一批祖师麻叶样品适量，精密称取6份，每份约0.5 g，依法制备供试品溶液，在上述色谱条件下分析测定。结果祖师麻甲素平均含量为0.81%，RSD为1.64%(n=6)，表明方法重复性良好。

加样回收试验:称取已知含量(0.81%)的祖师麻叶样品0.25 g，共 6份，精密称定，各精密加入对照品溶液(0.401 g/L)5 mL，按供试品溶液制备方法制成待测溶液，按上述色谱条件测定含量，计算回收率。结果见表1。

表1 祖师麻甲素加样回收测定结果(n=6)

2.4 样品含量测定

分别精密对照品溶液和供试品溶液各10μL，进样测定。结果 3批祖师麻叶样品的含量分别为 0.81%(皮部 0.45%)，0.56%(皮部 0.21%)和 0.63%(皮部 0.36%)。

3 讨论

曾比较了渗漉、浸渍、回流、连续回流4种不同提取方法的提取效率，结果显示同一批样品祖师麻甲素含量分别为0.81%，0.34%，0.38%，0.41%，渗漉法提取效率明显较优。虽然渗漉法相比其他几种方法操作稍麻烦，但其提取效率较优，最终确定以渗漉法为样品提取方法。有关渗漉法可大幅提高其提取效率的原因，有待进一步深入探讨。还考察了不同提取溶剂(95%乙醇、85%乙醇、65%乙醇、甲醇、85%甲醇、65%甲醇)的提取效率，结果显示，85%乙醇提取效率最高。

祖师麻药材在陕西秦岭地区的太白山有较大的蕴藏量，3个主要品种均有分布，其中以主流品种黄瑞香的分布较多，含量较高，而市场商品药材以黄瑞香和陕甘瑞香为主。故后续还需进一步考察陕甘瑞香以及不同生长季节的叶子样品，为其资源的开发提供理论依据。

[1]国家中医药管理局.中华本草(第5册)[M].上海:上海科学技术出版社，1999:407.

[2]李书慧，吴立军，殷红英.祖师麻化学和药理活性研究进展[J].中国中药杂志，2002，27(6):401.

[3]张文亮，李荣亨.瑞香素药理作用研究现状[J].实用中医药杂志，2007，23(6):402.

[4]党秋萍，周 军，刘建蜂.HPLC法测定祖师麻药材中祖师麻甲素的含量[J].陕西中医，2006，27(6):734.

[5]位海强，袁才英，杨金凤，等.祖师麻质量标准研究[J].广东药学，2004，14(3):1.

[6]蒋以号，杨武亮，陈海芳，等.HPLC测定不同基源及不同产地祖师麻中祖师麻甲素[J].中草药，2008，39(7):10.