流式细胞药敏试验在肺癌化疗中的应用

江永青，胡志坚，卢 敏，韩 峰，荀春华

(九江学院附属医院，江西 九江 332000)

全世界每年有超过100万人死于肺癌，国内肺癌的发病率和死亡率占城市恶性肿瘤的首位。合理化疗是有效抑制肿瘤发展，提高患者生命质量、延长生存期的重要途径。然而，目前肿瘤药物敏感实验常用MTT 法，此方法持续时间长、干扰因素多、且难以量化，以至医生难以及时准确用药。此外，目前药敏标本常来源于手术切除物，但大多肺癌患者就诊时已错过最佳手术期。为此我们采试用快速、准确的流式细胞术对纤支镜标本进行肿瘤药敏试验，为临床医生根据个体差异选择治疗方案提供参考。

1 材料与方法

1.1 临床资料 收集2010-2011年在本院住院的患者92例，其中男61例，女31例，年龄46-78岁，经病理及影像学检查证实为非小细胞肺癌者。根据患者用药情况，将其分成两组：实验组48例(经药敏实验指导给药)和对照组44例(根据医生经验给药)，两组的病情、性别、年龄、饮食习惯、职业及文化程度均无显著性差异。

1.2 方法 标本在取出后，应用机械法将其分离成单细胞悬液，用不连续密度梯度离心法纯化细胞，应用流式细胞仪的凋亡检测技术检测活细胞数>90%。细胞重悬于10%胎牛血清的RPMI 1640 培养液(含10%胎牛血清，100 IU／ml 青霉素及链霉素)，将细胞浓度调至1×105个/ml，接种24 孔板，每孔300μl细胞悬液，每种药物及组合设5个平行复孔。根据血药浓度将化疗药物分别加入各孔，分别长春瑞滨(NVB，2.40μg/ml),紫杉醇(PTX,3.60μg/ml),多西紫杉醇(DT,5.00μg/ml),吉西他滨(GEM,46.00μg/ml)，顺铂(CDDP,400.00μg/ml)，卡铂(CBP,100.00μg/ml)，依托泊苷(VP-16,9.40μg/ml),长春瑞滨 (2.40μg/ml)+顺铂 (400.00μg/ml),依托泊苷(9.40μg/ml)+顺铂(400.00μg/ml),吉西他滨(46.00μg/ml)+顺铂 (400.00μg/ml)。加药后12h 收获细胞约1×105个移人试管，PBS 洗涤1次，400μl Binding Bufer 重悬细胞。取200μl细胞悬液加入Annexin V5μl，PI10μl 避光20min，加入200μl Binding Buffer 上机检测。用Cellquest软件获取数据，Mod-Fit软件进行数据分析得出每组的凋亡率。肿瘤细胞凋亡率=加药组凋亡率-对照组凋亡率。根据药敏结果选择凋亡率最高的药物或药物组合，指导临床用药。根据RECIST 标准对两组进行疗效评价，分为完全缓解(CR)、部分缓解(PR)、稳定(SD)和进展(PD)，以CR+PR 计算有效率(RR)。

1.3 统计学方法 应用SPSS16.0软件进行统计学分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 药敏试验结果 非小细胞肺癌细胞经单药和联合用药的体外药敏试验结果，见表1。

表1 非小细胞肺癌细胞经单药和联合用药的体外药敏比较

2.2 治疗效果比较 实验组与对照组治疗效果比较，见表2。

表2 两组治疗效果比较[n(%)]

3 讨论

化疗是肺癌治疗中重要环节，尤其是在消除肺癌的微转移灶，控制中晚期肺癌的远处转移方面具有不可替代的作用，是多学科治疗中一个主要的重要组成部分。目前肺癌化疗单药有100 多种，临床医师在制定化疗方案时多根据经验用药，但由于肿瘤患者个体差异较大，不同类型的肿瘤对药物的敏感性亦不相同，即便是同一类型也存在着较大差异，由此导致化疗效果并不太理想。而肿瘤细胞体外化疗药物敏感试验的开展，对选择敏感化疗药物、实现对肿瘤患者的个体化治疗、减少盲目性和耐药的发生具有极其重要的临床意义。Sargent[2]总结了十多年的肿瘤药敏结果，发现卵巢癌体外试验结果与体内应用结果具相关性，且体外敏感药和不敏感药进行治疗后的5年生存率，前者高于后者。Von Hof[3]报道肿瘤体外药敏试验结果与体内疗效符合率为84.7%，阳性结果符合率为92.2%，阴性结果符合率为69.1%。这都说明了肿瘤药敏试验结果对临床用药的指导意义。理想的药物敏感试验应具备的条件是简单、快速、敏感，可筛选作用方式不同的药物。Schrag D[4]等认为不管何种技术，体外实验结果一定要与药物体内疗效有较好的符合率。

然而，目前肿瘤药物敏感实验常用MTT 法，此方法所获结果受多方因素的影响，如各复孔间误差、加药浓度、加药时间、MTT 作用时间、溶解剂作用时间等。MTT 法持续时间长、干扰因素多、且难以量化，以至医生难以及时准确用药。由于临床上用于肿瘤治疗的大多数抗癌药物都可在不同类型的肿瘤治疗中诱导肿瘤细胞凋亡，诱导细胞凋亡可能是决定化疗效果的重要因素[5,6]，而流式细胞术检测凋亡快速、准确，使其在临床肿瘤药敏试验的应用成为必然趋势。姚静[7]等对抗肿瘤药物敏感性的实验方法进行比较,结果发现流式细胞术可以检测到早期凋亡，检测到药物最大杀伤率的有效时间点明显早于MTT比色法。

此外，目前药敏标本常来源于手术切除物，但大多肺癌患者就诊时已错过最佳手术期。本次试验以纤支镜标本为试验对象，可增加试验者范围，减少患者取材的痛苦，又可充分发挥流式细胞术所需标本量少的优势。

我们用快速、准确的流式细胞术对纤支镜标本进行肺癌体外药敏试验，以指导临床合理用药。试验结果显示，各种化疗药物的敏感度不同，而且没有对所有病人都敏感的药物，因此每种药物对个体病人的有效性不一。实验组的有效率为72.91%，明显高于对照组(40.91%),表明针对个体组成的合理化疗方案对病情的控制明显高于仅凭经验的普通化疗方案。因此我们应筛选出较敏感的化疗药物，组成合理的化疗方案，将化疗具体到每一个肺癌病人，指导临床治疗，争取取得最佳的诊疗效果，以延长患者生存期和改善生活质量。

[1]乔亚峰，叶振东，张国雄，等.血培养常见病原菌的分布及耐药性分析[J].实验与检验医学,2011,29(2):136-137.

[2]Sargent JM.The use of the MTT assay to study drug resistance infresh tumour samples[J].Cancer Res，2003，161(1) ∶13-25.

[3]Von Hoff DD.In vitro predictive testing:the sulfonamide era[J].Int J Cell Cloning.1987.5(3):179-190.

[4]Schrag D,Garewal HS,Burstein HJ,et al.American society of clinical oncology technology assessment:chemotherapy sensitivity and resistance assays[J].Clin Oncol,2004,22:3631-3638.

[5]Debatin KM.Apoptosis pathways in cancer and cancer therapy[J].Cancer Immunol Immunother，2004，53：153-159.

[6]Hu W,Kavanagh JJ.Anticancer therapy targeting the apoptotic pathway[J].Lancet Oncol,2003,4(12):721.

[7]姚 静,李小兰,李伟华,等.抗肿瘤药物敏感性实验方法的比较.中华实验外科杂志[J]，2005，7：792-793.