糖尿病肾病患者血清miRNA-93的表达变化及意义

杨 阳，张运津，谢 安，汪 泱，娄远蕾

(1、南昌大学第一附属医院泌外研究所，江西 南昌 330006；2、南昌大学附属口腔医院；3、江西广济医院)

miRNA 作为天然的基因调控因子在胚胎发育、细胞分化、血管形成、肿瘤发生等许多重要病理生理过程中发挥着重要的调控作用[1]。大量研究表明差异表达的miRNA与许多疾病的发生发展有关[2-4]，有望成为其早期诊断标志物和潜在的治疗靶点。虽然目前研究表明miRNA 参与糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)的发生发展，但都是基于动物模型和体外实验，而临床DN的相关研究目前鲜见报道。本文通过分析现有文献报道，选择miRNA-93 进行实时荧光定量PCR(quantitative real time polymerase chain reaction，qRT-PCR) 检测，分析其在糖尿病肾病患者血清和健康对照组血清的表达差异；探讨其与DN 发生、发展等之间的关系，以明确其在DN 发生过程中的作用。

1 材料与方法

1.1 研究对象 选择2010年8月—2011年3月在南昌大学第一附属医院肾内科确诊为DN的患者为研究对象。收集其血清标本共计20例。其中男性8例，女性12例；年龄33～76岁，平均52.8岁；DN 临床分期：Ⅰ期-Ⅳ期(非尿毒症组)12例，Ⅴ期(尿毒症组)8例。对照组为20例健康体检的正常血清。所有标本-80℃保存。以上标本收集均通过医院伦理委员会批准并签署了知情同意书。

1.2 主要试剂和仪器 miRcute miRNA 提取分离试剂盒、miRcute miRNA cDNA 第一链合成试剂盒、miRcute miRNA 荧光定量检测试剂盒均购自北京天根生化科技有限公司。其它常规化学试剂均为分析纯产品。Tpersonal PCR 仪(德国Biometra)，实时定量PCR 仪step one plus(美国ABI)。

1.3 方法

1.3.1 qRT-PCR 检测miRNA-93的表达 按miRcute miRNA 提取分离试剂盒、miRcute miRNA cDNA 第一链合成试剂盒、miRcute miRNA 荧光定量检测试剂盒说明书操作。以U6为内参，引物序列及PCR 产物片断大小为：miRNA-93 上游CAAAGTGCTGTTCGTGCAGGTAG，下游引物为试剂盒提供的通用引物，扩增产物为76bp；U6 上游：CTCGCTTCGGCAGCACA，下 游：AACGCTTCACGAATTTGCGT，扩增产物为94bp。数据采用2-△△CT法进行分析。

1.3.2 生物信息学预测miRNA-93 靶基因 采用targetScan (http://www.targetscan.org)、PicTar (http://picTar.mdc -berlin.de)、miRanda (http://microrna.sanger.ac.uk)、miRDB (http://miRNAdb.org/miRDB)4个软件在线预测miRNA-93 靶基因。

1.3.3 统计学分析 以上实验重复3 遍，实验数据用中位数和四分位数间距[M(P25,P75)]表示，采用GraphPad Prism 5软件进行统计学分析。独立样本比较应用非参数Mann-Whitney 检验，P<0.05为有统计学意义。

2 结果

2.1 DN组和健康对照组血清miRNA-93的表达情况 qRT-PCR显示miRNA-93 在DN组的表达明显低于健康对照组，差异有统计学意义(P＜0.05)，见图1。

图1 两组血清标本miRNA-93表达比较

2.2 miRNA-93的表达与DN 临床病理参数间的关系 尿毒症组患者血清miRNA-93表达水平明显低于非尿毒症组患者，差异有有统计学意义(P＜0.05)。不同的性别、年龄之间无差异。见表1。

表1 miRNA-93的表达与DN 临床病理参数间的关系

2.3 miRNA-93 靶基因预测 TargetScan 预测miRNA-93 靶基因为50个，PicTar 预测为613个，mi-Randa 预测为9156个，miRDB 预测为293个。预测的结果显示miRNA-93 调节的靶基因范围非常广泛，涉及血管形成、信号转导、细胞增殖、细胞凋亡、细胞分化等各个方面。其中6个基因与DN 相关：VEGFA、MTHFR、ADRA2B、SDC2、APOB、PPARG。

3 讨论

DN 是导致糖尿病(DM)患者死亡的主要原因，也是尿毒症的第二病因，因此DN 严重危害DM 患者的健康与生命，加重社会与家庭的经济负担。但是由于DN 起病隐匿，进展缓慢，早期临床症状不典型，而临床一旦出现蛋白尿时，其进程难以逆转，大约7年内有50%进入尿毒症期，最终发展为终末期肾病(ESRD)。因此，DN的早期诊断和治疗就成为目前亟待解决的问题。miRNA 作为天然的基因调控因子在胚胎发育、细胞分化、血管形成、肿瘤发生等许多重要病理生理过程中发挥着重要的调控作用[1]，有望成为许多疾病的早期诊断标志物和潜在的治疗靶点。

目前研究表明miRNA 参与DN的发生发展。Kato[5]研究组采用芯片、qRT-PCR、质粒转染及流式细胞术等方法进行体内、体外实验，结果表明在小鼠糖尿病动物模型和小鼠肾系膜细胞中miRNA-192表达上调；miRNA-192的靶基因为smad-l 作用蛋白(slPl)；slPl 是TGF-β-smad 通路的重要内源性阻遏物，高表达的miRNA-192 通过对sIPl 抑制促进TGF-β 介导的肾小球系膜细胞增殖及细胞外基质的合成，从而导致糖尿病肾病的发生发展。该研究小组[6]也证实，在糖尿病肾病动物模型中，高表达的miRNA-216a 通过下调靶基因YB-1 蛋白(一个RNA 连接蛋白)调节TGF-β1的翻译。TGFβl 是细胞外基质蛋白的一个主要调控因子。Long[7]等研究表明miRNA-29c 在小鼠DN 模型的肾小球、高糖处理的足突细胞及微血管内皮细胞中都有表达，并能诱导细胞凋亡和细胞外基质蛋白的积累；并证实miRNA-29c的靶基因为信号转导调控因子Spry1,过表达的miRNA-29c 通过下调Spry1 促进Rho 激酶的活化；敲除miRNA-29c 能减少动物模型的蛋白尿和细胞外基质纤维连接蛋白的积累。提示miRNA-29c 通过Spry1/Rho 通路促进DN的进展。使用同样的技术方法，Long[8]还证实miRNA-93的靶基因是血管内皮生长因子A(VEGFA)。转染miRNA-93 能抑制VEGFA 3’-UTR的转录和使高糖环境诱导的VEGFA 蛋白分泌减少；相反，使用miRNA-93 抑制剂后则使VEGFA的表达迅速增加。VEGFA 是一种二聚体糖蛋白，在血管生成、血管的内稳态平衡和维持毛细血管军完整性等方面具有重要作用，特别是在肾小球的形成和功能方面具有重要的调节作用。在DN 动物模型肾脏中，VEGFA 是高表达的，干扰其表达后肾功能得到明显改善。

已有的研究都是基于动物模型和体外实验，对临床DN的相关研究目前鲜见报道。本课题通过对现有文献报道的分析，利用qRT-PCR 方法检测miRNA-93 在糖尿病肾病患者血清和健康对照组血清的表达情况，发现miRNA-93 在DN组的表达明显低于健康对照组，尿毒症组患者血清miRNA-93表达水平明显低于非尿毒症组患者，提示miRNA-93可能在在糖尿病肾病发生过程中起着重要作用。靶基因预测分析的结果显示miRNA-93 调节的靶基因范围非常广泛，涉及血管形成、信号转导、细胞增殖、细胞凋亡、细胞分化等各个方面。其中6个基因与DN 相关，分别是：VEGFA、亚甲基四氢叶酸还原酶 (MTHFR)、α-2B 肾上腺素受体(ADRA2B)、多配体聚糖2 (SDC2)、载脂蛋白B(APOB)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARG)。推测在DN 中，低表达的miRNA-93可能通过下调其靶基因来发挥作用，从而参与DN的发生发展，但具体机制尚有待进一步研究。

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[6]Kato M,Wang L,Putta S，et al.Post-transcriptional up-regulation of Tsc-22 by Ybx1,a target of miR-216a,mediates TGF-{beta}-induced collagen expression in kidney cells [J].J Biol Chem,2010,285(44):34004-34015.

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