IL13RΑ2 SNPs与非小细胞肺癌的相关性研究

贺霄羽，熊莺，孙 午

(1、南昌市三三四医院,江西 南昌 330024；2、九江市第一人民医院检验科,江西 九江 332000)

肺癌是常见的导致死亡的恶性肿瘤之一，在我国肺癌死亡占癌症死亡病因的第3 位，且发病率有逐年增加的趋势。肺癌分为小细胞肺癌(SCLC，15%～25%)和NSCLC(NSCLC，75%～85%)，而NSCLC 占到原发肺癌的80%～85%。肺癌是一种多基因遗传病，目前已发现很多NSCLC 相关基因，如RAS 基因家族、MYC 基因家族、ERBB 基因家族、P53、RB等[1]，研究发现体内众多免疫细胞和肿瘤细胞分泌的多种生长因子和细胞因子在正常组织内不表达或痕量表达，而在肿瘤尤其是恶性肿瘤有表达。本研究可推测NSCLC 患者外周血中检测到IL-13Rα2 蛋白的表达。IL-13Rα2 基 因(IL13RΑ2)位于Xq13.1-q28，共有九个外显子，其中第七外显子上有一个cSNPs(rs17095919)，我们已知虽然吸烟是肺癌发病的高风险因素，但只有10%～15%的吸烟者最终发展成为肺癌，说明了个体基因差异性对肺癌的易感性起了重要作用。本实验主要研究这个cSNPs 是否与NSCLC 易感性相关，为NSCLC 早期诊断提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料 550型号微孔板酶标仪(伯乐太平洋有限公司)；Real-time PCR 试剂(全式金公司)；ELISA试剂盒(美国R&D 公司)；实时荧光定量PCR 仪(达安7600)；生物安全柜(复星公司)。

1.2 方法 50例原发性肺癌患者为2011年3月至2012年3月在南昌市三三四医院和九江市第一人民医院胸外科进行手术治疗的患者，术前未行化疗和放疗，所有的标本均经组织病理学确诊为原发性肺癌。50个无肿瘤病史和体征的正常对照随机选自江西地区例行体检的健康人群。标本采集及外周血白细胞DNA的提取所有研究个体均采集外周静脉血5ml，经枸橼酸钠抗凝，4℃冰箱保存。

1.2.1 ELISA 法检测NSCLC 病例组与健康对照组之间静脉血IL-13Rα2 蛋白表达差异。

1.2.2 采血后一周内以蛋白酶K 消化-饱和氯化钠盐析法提取外周血白细胞DNA。

1.2.3 应用针对C和T等位基因的Taqman 探针对基因型鉴定，分析NSCLC 病例组和健康对照组IL13RΑ2 SNP 位点的基因型。IL13RΑ2 rs17095919(C256T) 引物为:Forward primer 5’-ACCTTTGCCGCCAGTCTATCTTAC -3’；Reverse primer 5’ -TGTCGGGTTTCATTTGTTGTTTTC-3’，针对C和T等位基因的Taqman 探针。反应体系总体积为25μl，包括模板DNA2μl，10×缓冲 液2.5μl，250 mmol/L MgCl20.3μl，10 mmol/L dNTP 0.7μl，正向引物0.5μl，反向引物0.5μl，特异性探针0.5μl。余量用蒸馏水补足。反应条件：95℃15 min，接着是45个循环：95℃变性20 s，58℃退火20 s，72 ℃延伸20 s。直接观察实时荧光定量PCR的反应曲线，扩增曲线发生抬高的证实为存在与Taqman 探针对应的等位基因。

1.3 统计学分析 实验数据使用SPSS13.0软件进行数据分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ELISA 方法检测结果可以发现正常人几乎无IL-13Rα2 蛋白的表达，NSCLC 病例组IL-13Rα2蛋白水平达到5.7ng/ml(SD=0.34)，与健康对照组之间相比静脉血IL-13Rα2 蛋白表达明显增加(P<0.05)。

2.2 NSCLC 患者和健康对照组的IL13RΑ2的等位基因频率分布见表1，等位基因频率分别为49.0%、51.0%和48%、52%，经统计学分析，无显著性差异。在两组人群中，等位基因C和T 频率均符合Hardy-Weinberg 平衡法则。NSCLC 患者和健康对照组的IL13RΑ2的基因型分布见表2，可以发现NSCLC 患者IL13RΑ2的基因型C/T与健康对照存在显著差异，因此可以认为IL-13RA2的C/T 基因型与NSCLC 易感性相关，其他基因型在组间分布差异无统计学意义，与NSCLC 易感性无关。

表1 等位基因频率分布

3 讨论

我国肺癌的发病率和死亡率逐年升高，位居城市人口中恶性肿瘤之首。表皮生长因子受体(EGFR)在多种恶性肿瘤的发病和加重过程中起了重要作用，在台湾人群中EGFR 基因的多态性与不吸烟的女性肺腺癌患者发病过程高度相关[2]。国内对肺癌诊断的联合指标进行了广泛的研究，包括TPS、NSE、CEA、LunXmRNA 及血清骨保护素等指标在肺癌诊断中价值[3-5]。韩国的1项研究表明了转化生长因子TGF-β 基因SNPs与肺癌的发病和预后的关系，A-1572G，C-509T和T+869C 在杂合子基因型携带者的重度吸烟者肺癌发病风险高[6]。这些众多研究表明细胞因子及其受体基因表达的多态性与肺癌的发病风险增加和病程发展高度相关。IL-13 主要由激活的辅助T 淋巴细胞(Th2)细胞、肥大细胞、自然杀伤细胞和嗜碱性粒细胞产生，它是一种多功能的细胞因子，起着调节炎症、黏液产生、组织重建和纤维化的作用。我们已经发现IL-13的高亲和力受体IL-13Rα2 过度表达在许多种固体癌细胞上如小儿脑瘤、恶性胶质瘤、卵巢癌、星形细胞瘤等。这说明IL-13Rα2的表达与癌症高度相关。IL-13的高亲和力受体：IL-13 受体α2 在正常组织表达很低，O'Toole M等人用一种独特ELISA 方法研究证实正常人血浆中无IL-13Rα2表达[7]，却在肿瘤上有着高表达。Daines MO等人研究证实IL-13Rα2 有三种形式：细胞膜表面、细胞内和一种可溶形式 (sIL-13Rα2)，IL-13Rα2 蛋白主要存在细胞内，膜表面IL-13Rα2 释放于介质中即表现为sIL-13Rα2，并且胞质内IL-13Rα2 不断运输至细胞表面补充膜表面IL-13Rα2[8]。而sIL-13Rα2的表达可被炎症反应[9]、寄生虫感染[10]、变态反应和激惹[11]所诱导，本实验也证实了sIL-13Rα2与NSCLC 有关。因为cSNPs可以进行疾病的遗传连锁分析及关联分析，用于疾病易感基因定位，本研究进一步证实IL-13RA2 基因cSNPs：rs17095919(IL13RΑ2 第七外显子第一密码子256 位置C/T)SNP与NSCLC的发病风险相关。其中NSCLC组的C/T 杂和基因型频率明显高于对照组，其他基因型在各组间分布差异无统计学意义，提示IL-13RA2 基因C/T 基因型为NSCLC 易感基因型，IL-13RA2 其他基因型与NSCLC 无关。遗传学家认为，对复杂多基因疾病的研究，要综合考虑种族、样本量、实验手段、统计方法，甚至不同疾病的生理、病理等多方面因素的考虑，才能得到科学的、可信的结论。因此我们通过对IL-13RA2 单核苷酸多态性与NSCLC的发生机制深入研究，确定了IL-13RA2 SNPs的C/T 基因型与NSCLC的强相关关系，对NSCLC的诊断和治疗将更有针对性，甚至做到个体化。同时建立有效的预警系统后，达到有效的一级预防目的，将大大减少NSCLC 患者的发病率，从而降低NSCLC 患者的诊疗费用。NSCLC 鳞癌和腺癌IL13RΑ2 单核苷酸多态性之间的相关性在本研究中未发现显著性差异，但有待进一步研究。

[1]linna JD.Molecular pathogellesis oflung carIoer[J].Cancer，2000，29(2)：37-38.

[2]Jou YS,Lo YL,Hsiao CF,et al.Association of an EGFR intron 1 SNP with never-smoking female lung adenocarcinoma patients [J].Lung Cancer,2009,64(3):251-256.

[3]蔡常辉，杜满兴.TPS 检测及与CYFRA21-1、NSE、CEA 联检对肺癌的诊断价值[J].实验与检验医学,2010,28(2):145-146.

[4]殷金兰，陈肖燕.血清骨保护素在肺癌诊断中的临床价值[J].实验与检验医学,2009,27(1):7-9.

[5]应漂漂,王茂峰,王巧燕,等.LunX mRNA 联合CEA、SCCA、CYFRA21-1 三项肿瘤标志物诊断非小细胞肺癌的临床应用价值[J].实验与检验医学,2009,27(6):591-594.

[6]Park KH,Lo Han SG,Whang YM,et a1.Single nucleotide palymorphisms of the TGFB1 gene and lung cancer risk in a Korean population[J].Cancer Genet Cytogenet,2006,169(1):39-44.

[7]O'Toole M,Legault H,Ramsey R,et al.A novel and sensitive ELISA reveals that the soluble form of IL-13R-alpha2 is not expressed in plasma of healthy or asthmatic subjects[J].Clin Exp Allergy,2008,38(4):594-601.

[8]Daines MO,Tabata Y,Walker BA,et al.Level of expression of IL-13R alpha 2 impacts receptor distribution and IL-13 signaling[J].Immunol,2006,176(12):7495-501.

[9]David M,Ford D,Bertoglio J,et al.Induction of the IL-13 receptor alpha2-chain by IL-4 and IL-13 in human keratinocytes:involvement of STAT6,ERK and p38 MAPK pathways [J].Oncogene,2001,20(46):6660–6668.

[10]Mentink K,Cheever AW,Thompson RW,et al.IL-13 receptor α2 down-modulates granulomatous inflammation and prolongs host survival in schistosomiasis [J].Proc Natl Acad Sci USA,2004,101(2):586–590.

[11]Yasunaga S,Yuyama N,Arima K,et al.The negative-feedback regulation of the IL-13 signal by the IL-13 receptor 2 chain in bronchial epithelial cells[J].Cytokine,2003,24(6):293–303.