解淀粉芽孢杆菌ptsGHI基因的敲除及缺陷株生长特性*

杨慧林 王坤 廖瑜玲 王斌 林影 潘力

(华南理工大学生物科学与工程学院，广东广州510006)

解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)是一种革兰氏阳性细菌，与枯草芽孢杆菌的种属同源性较高，其基因组序列已于2007年公布［1］.目前，解淀粉芽孢杆菌广泛用于生产核苷及多聚氨基酸等，如肌苷、鸟苷及 γ-聚谷氨酸［2-4］.此外，广泛运用的淀粉酶［5］和BamHⅠ限制性内切酶［6］也都来源于解淀粉芽孢杆菌.

在大肠杆菌和枯草杆菌中，葡萄糖主要是通过磷酸转运系统(PTS)转运至胞内［7-8］.磷酸转运系统由ptsI基因编码的EI、ptsH基因编码的HPr及ptsG基因编码的EIIGlc3种酶完成，其过程大致为磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)的磷酸基团通过EI和HPr传递给经EIIGlc运输至胞内的葡萄糖，从而完成葡萄糖的转移.在大肠杆菌中，ptsG和ptsHI位于基因组的不同位置，而在枯草杆菌中，ptsGHI组成一个操纵子表达.Escalante等［9］通过敲除大肠杆菌的磷酸转运系统，提高了莽草酸的产量;韩聪等［10］构建了一株大肠杆菌ptsG基因缺陷株，其最高菌密度为野生型菌株的4.25倍.国内外关于枯草芽孢杆菌磷酸转运系统的研究仅有少数报道［7，11-12］，且至今未见关于解淀粉芽孢杆菌磷酸转运系统的报道.

文中通过温敏型质粒介导的同源重组双交换的方法，敲除解淀粉芽孢杆菌XH7的ptsG和ptsHI基因，并研究其缺陷株生长特性及鸟苷产率，以期为解淀粉芽孢杆菌磷酸转运系统机制的研究及运用奠定基础.

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株与质粒

Escherichia coli Mach1T1购于Invirtogen公司，Escherichia coli JM110来源于广东省微生物菌株保藏中心，Bacillus amyloliquefaciens XH7由笔者所在实验室保存;Escherichia coli TG1和质粒pKS1(温度敏感型复制子，Ermr，Kanr)由美国纽约大学医学院惠赠.质粒pKS2为pKS1的衍生质粒(删除了3个BamHⅠ限制性内切酶位点).

1.1.2 主要试剂和仪器

FastDigestTM快速限制性内切酶、FastAPTM热敏感碱性磷酸酶、T4 DNA连接酶购自美国Fermentas公司;T4多聚核苷酸激酶、pSIMPLE-18 Eco R V/BAP载体购自宝生物工程(大连)有限公司;抗生素Amp、Kan购自北京普博欣生物科技有限公司;细菌基因组DNA提取试剂盒和KOD-Plus-Neo高保真性PCR酶购自东洋纺(上海)生物科技有限公司;质粒小提试剂盒和胶回收试剂盒购自美国Omega公司;葡萄糖浓度测定采用南京建成公司的葡萄糖检测试剂盒;其它试剂均为分析纯.

1.1.3 培养基及培养条件

LB培养基(g/L):蛋白胨10，酵母粉5，氯化钠10;LBG培养基(g/L):蛋白胨10，酵母粉5，氯化钠10，葡萄糖20;LBS培养基(g/L):蛋白胨10，酵母粉5，氯化钠10，山梨醇90;种子培养基(g/L):葡萄糖20，蛋白胨 10，酵母粉 10，味精 5，NaCl 5，腺嘌呤0.05，pH=7.0;发酵培养基(g/L):葡萄糖 120，酵母粉16，(NH4)2SO415，KH2PO42，MgSO4·7H2O 4，味精10，CaCO325，pH值调节至6.5后灭菌，葡萄糖和CaCO3分消.大肠杆菌用LB培养基培养，除含有温敏型质粒的大肠杆菌要置于30℃下培养外，其它均于37℃下培养.

1.1.4 引物

引物P1与P2用于对pKS1质粒进行改造，消除pKS1上的3个BamHⅠ位点;引物P3与P4、P5与P6分别用于PCR扩增ptsG基因的左、右同源臂;引物P7与P8、P9与P10分别用于PCR扩增基因ptsHI的左、右同源臂;引物P11与P12用于PCR鉴定ptsG基因缺陷突变株;引物P13与P14用于PCR鉴定ptsHI基因缺陷突变株.引物P1、P2的斜体部分为SmaⅠ和BglⅠⅠ酶切位点，其它引物的下划线部分是方向重复序列，作为融合PCR扩增的重叠区，具体引物序列见表1.

表1 实验所用引物Table 1 Primers in the investigation

1.2 方法

1.2.1 温敏型质粒pKS2及ptsG和ptsHI基因敲除质粒的制备

以质粒pKS1为模板、P1和P2为引物进行PCR扩增得到一段含有红霉素抗性基因的DNA片段.DNA片段连接pSIMPLE-18 Eco R V/BAP载体后用SmaⅠ和BglⅠⅠ双酶切胶回收，pKS1质粒用SmaⅠ和BamHⅠ双酶切胶回收，利用BamHⅠ和BglⅠⅠ为同尾酶的特性，将两片段连接成一个新的质粒pKS2，此质粒不含有Bam HⅠ位点.pKS1的图谱信息及引物设计位置如图1所示.

图1 温敏型质粒pKS1图谱及引物P1与P2的位置Fig.1 Profile of temperature-sensitive plasmid pKS1 and positions of primers P1 and P2

以Bacillus amyloliquefaciens XH7的基因组为模板，以P3和P4、P5和P6为引物进行PCR扩增得到ptsG基因的左、右同源臂，再分别以回收的左右同源臂为共同模板，以P3和P6为引物进行重叠PCR得到ptsG基因的左右同源臂片段C1.线性片段C1经磷酸化处理后，连接到经SmaⅠ酶切及去磷酸化处理的线性化载体pKS2，最终构建得到ptsG基因的敲除质粒pKS2-ptsG;按相同的方法，以P7和P8、P9和P10为引物，构建ptsHI基因的敲除质粒pKS2-ptsHI.

1.2.2 ptsG和ptsHI基因的快速敲除及鉴定

ptsG和 ptsHI基因的快速敲除分4个步骤进行:(1)参考文献［13］中的方法制备 Bacillus amyloliquefaciens XH7电转感受态细胞.(2)电转化:取5μL敲除质粒至100μL感受态细胞并混匀，冰浴后将混合物转移至已预冷的2mm电击杯中，2500V、25μF、200 Ω电击转化，电击完成后迅速加入1 mL LBS培养基，在30℃下，以130 r/min振荡3 h培养后涂布Kan平板(5 mg/L)，筛选阳性转化子.(3)诱导敲除:单菌落转化子接种到LB液体培养基中，37℃下培养过夜后涂布Kan平板(5 mg/L)并置于37℃下培养，长出的即为发生同源重组单交换的转化子;转接单交换的转化子到LB中，30℃下培养36h后，涂布到LB平板，置于37℃下培养12 h后随机挑取平板中40个单菌落接种于Kan平板，选择Kan平板上不生长的对应的单菌落进行菌落PCR鉴定.基因敲除策略见图2.(4)菌落PCR鉴定:以引物P11和P12进行菌落PCR鉴定在Kan平板不生长的ptsG敲除株，若PCR扩增不出来，证明敲除成功，若能扩增出来，说明回复突变成野生型(WT);按同样的原则，以引物P13和P14进行菌落PCR鉴定ptsHI敲除株.

图2 无标记基因敲除策略Fig.2 Knockout strategy of markerless gene

1.2.3 菌体生长曲线的绘制

分别挑取野生型的Bacillus amyloliquefaciens XH7、ptsG敲除株和ptsHI敲除株单菌落于10mL LB培养基上，37℃、200r/min下培养过夜后取100μL菌体转接至10mL LB及LBG中，37℃、200r/min下继续培养，定时测定菌体密度，从而绘制出菌体生长曲线.

1.2.4 鸟苷发酵及产量测定

分别挑取野生型的Bacillus amyloliquefaciens XH7、ptsG敲除株和 ptsHI敲除株单菌落于20 mL种子培养基上，37℃、200 r/min下培养至600 nm下光密度(D(600))约为5.0，然后取2mL接种至装有25mL发酵培养基的500mL挡板三角摇瓶中37℃、200r/min下培养66 h.培养结束后，用NaOH调至pH=10.0后沸水浴5min，离心取上清即为提取的鸟苷产物.鸟苷含量的测定采用HPLC法，具体条件见文献［14］.

2 结果和分析

2.1 敲除质粒的构建及基因敲除

Shatalin等［15］利用温敏型质粒pKS1成功地敲除了Bacillus anthracis的racE1和racE2基因.文中用pKS1转化解淀粉芽孢杆菌时发现转化率极低.解淀粉芽孢杆菌产BamHⅠ限制性内切酶，而质粒pKS1上有3个BamHⅠ位点，因此，质粒pKS1转化进入解淀粉芽孢杆菌后会被内源的BamHⅠ限制性内切酶降解.文中通过分子改造，消除了pKS1上的3个Bam HⅠ位点，使转化效率提高了1 000倍左右，转化效率达每微克DNA 2.5×103.

ptsG基因和ptsHI基因的左、右同源臂通过融合PCR连接成一个完整的DNA片段(见图3(a))，DNA片段经过磷酸化处理后连接到pKS2质粒的SmaⅠ位点.按图2所示方法敲除ptsG及ptsHI基因，经PCR鉴定，鉴定引物为P3和 P6、P7和 P10、P11和P12、P13和P14，ptsG基因缺陷株用引物P3和P6能扩增出约2 kbp的片段，用引物P11和P12不能扩增出PCR产物，而ptsHI基因缺陷株用引物P7和P10能扩增出约2 kbp的片段，用引物P13和P14不能扩增出PCR产物(见图3(b))，这说明获得的敲除株是正确的.

图3 同源臂融合片段的构建及基因缺陷株的PCR鉴定Fig.3 Construction of homologous arm fusion fragments and PCR identification of gene deficient strains

2.2 ptsG和ptsHI基因缺陷株及野生型菌株在LB和LBG中的生长特性比较

在LB培养基中，ptsG及ptsHI基因缺陷株的生长状况与野生型(WT)菌株无明显差异(见图4(a))，其大约在10h时进入平稳区，最高菌体密度约为8.0.由于LB培养基中基本不含葡萄糖，敲除ptsG和ptsHI对其菌体的生长基本上没有影响.

在含有2%葡萄糖的LB培养基中，ptsG和ptsHI基因缺陷株及WT菌株的生长特性表现出较大差异.在LBG中，WT菌株的最高菌密度比其在LB中提高了50%，表明添加葡萄糖可以促进解淀粉芽孢杆菌的生长;在LBG中，ptsG基因缺陷株的最高菌密度比其在LB中提高了90%，比WT菌株在LBG培养基中的最高菌密度提高了28%，这说明敲除ptsG基因后，提高了解淀粉芽孢杆菌对葡萄糖的利用效率，促进了菌体的生长;但是，ptsHI基因缺陷株的生长状况与其在LB中基本一致，这说明敲除ptsHI基因阻断了解淀粉芽孢杆菌对葡萄糖的利用，ptsHI基因是葡萄糖利用的必需基因(见图4(b)).从LBG培养基中残余葡萄糖的浓度可以看出:WT菌株消耗葡萄糖的速度最快，当培养至18 h左右时，葡萄糖基本耗尽;敲除ptsG基因降低了葡萄糖消耗速度，表明ptsG基因参与的磷酸转移酶系统不是菌株葡萄糖吸收的唯一通道，还存在其它途径可吸收利用葡萄糖;敲除ptsHI基因后，菌株不再吸收葡萄糖，因此其葡萄糖的浓度保持不变(见图4(c))，从而造成ptsHI基因缺陷株的最高菌密度比WT菌株降低了约32%.

在解淀粉芽孢杆菌中，葡萄糖主要是通过磷酸转运系统运输至胞内.ptsG编码的酶EIIGlc是一种葡萄糖专一性的膜运输蛋白.敲除ptsG基因后，并没有完全阻断解淀粉芽孢杆菌对葡萄糖的吸收，此时，葡萄糖仍可通过manP基因编码的酶EIIMan运输至胞内［16］.在含葡萄糖的培养基中，本研究发现ptsG基因缺陷株的最高菌密度比野生型菌株提高了28%，可能原因是敲除ptsG基因后，降低了葡萄糖的利用速度以及副产物的产生.与ptsG敲除菌比较，ptsHI敲除菌彻底阻断了葡萄糖经过PTS途径入胞，在富含葡萄糖的LBG及发酵培养基中的生长速度均较差，不利于菌体生长及产物合成，此结果与周军智等［10，17］的报道相一致.

图4 ptsG及ptsHI缺陷株在LB及LBG培养基中的生长曲线及葡萄糖消耗情况比较Fig.4 Comparison of growth curves and glucose concentration of ptsG and ptsHI deficient strains in LB and LBG mediums

2.3 ptsG和ptsHI基因缺陷株的鸟苷发酵及分析

按照第1.2.4节所述方法，对ptsG和ptsHI基因缺陷株及WT菌株进行鸟苷发酵实验，发酵后用HPLC法检测鸟苷产量，结果如表2所示.

表2 ptsG和ptsHI基因缺陷株及WT菌株的鸟苷产量及pH值Table 2 Guanosine production and pH value of ptsG and ptsHI genetic defect strains and wild-type strain

从表2可看出，敲除 ptsG基因后，鸟苷产量比WT菌株提高了约24%，而敲除ptsHI基因后，鸟苷产量比WT菌株降低了约82%.发酵培养基中葡萄糖含量达0.12g/mL，因此，敲除 ptsHI基因后会直接影响菌体对葡萄糖的利用，导致菌体缺乏碳源而无法持续生长.从发酵66h后的pH值也可看出，ptsHI缺陷株的pH值明显高于野生型及ptsG缺陷株，这说明发酵66h后，ptsHI缺陷株已发生自溶.

3 结语

解淀粉芽孢杆菌ptsG基因产物与大肠杆菌crr基因产物具有同源性，敲除ptsG基因后解除了解淀粉芽孢杆菌的分解代谢阻遏效应(葡萄糖效应)，从而促使ptsG缺陷株在利用葡萄糖的同时能够高效利用LB复合培养基中的其它碳源底物;另外，葡萄糖利用速率的降低有利于减少副产物的产生，从而提高了葡萄糖的利用效率.与野生型菌株相比，敲除ptsG基因后，菌体的最高密度更高，且平稳期更长.文中通过鸟苷发酵实验证实，这种特性的改变可以增加鸟苷的产量，但是提高的幅度不大.后续实验希望能够敲除manP基因，看能否进一步改变菌体的生长特性，或者重构葡萄糖的运输途径，为构建高效合成鸟苷的工程菌打下基础.

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