平喘宁对哮喘大鼠肺组织cAMP/cGMP及TGF-β1mRNA表达的影响

方向明，袁亚美，王丽娜，胡 谦

（安徽中医学院，安徽 合肥 230038）

平喘宁为治疗临床寒性哮喘的有效方剂，由射干麻黄汤和三子养亲汤化裁而成，功效温肺化痰、止咳平喘、息风止痉，治疗寒哮。第二信使cAMP、cGMP可能是阴阳学说的物质基础之一，多篇文献报道cGMP含量升高、cAMP/cGMP比值降低是阳虚证的特征，是判断肺阳虚模型复制成功的指标。TGF-β是已知最强的致纤维化因子之一［1］，其功能的发挥主要取决于TGF-β1。肺组织中的TGF-β1基因表达强度与胶原的含量成明显正相关［2］，并作为TGF家族的多效细胞因子，在气道高反应性（AHR）与气道急性炎症反应中发挥抑制性作用。但在气道受到抗原的反复刺激造成慢性炎症时，气道中的TGF-β1持续性增高，进而引起或促进气道重建和肺组织纤维化［3-4］。该实验通过平喘宁干预寒性哮喘大鼠模型，采用逆转录-聚合酶链式反应（RTPCR），检测哮喘大鼠肺脏的TGF-β1mRNA表达水平，研究该药治疗寒性哮喘的分子生物学效应机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 8月龄健康雄性Wistar大鼠70只，体重200 g～220 g，普通级，安徽医科大学动物实验中心，许可证号：SCXK（皖）2011-002。

1.1.2 药物与试剂 平喘宁方药组成：麻黄、杏仁、苏子、半夏等，饮片来源：安徽中医学院国医堂制剂中心，分别煎制成3级浓度生药，浓度分别为4.2 g/mL（大剂量）、2.1 g/mL（中剂量）、1.05 g/mL（小剂量）。地塞米松片：上海信谊药业有限公司产品（批号：030402）；桂龙咳喘宁：山西桂龙医药有限公司（批号：Z20053135）。卵蛋白（OVA）（美国Sigma公司，批号：A8040），3%戊巴比妥钠（德国Merok公司，批号：20070923），SP免疫组化染色试剂盒（中山生物技术有限公司），DAB显色剂试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司），Trizol试剂（美国Invitrogen公司），逆转录试剂盒（Promega公司），目的基因和GAPDH引物（上海捷瑞生物技术有限公司），DEPC（美国Gibico公司），EB（美国Sigma公司）。

1.1.3 实验仪器 402AI型鱼跃牌超声雾化器（上海鱼跃医疗设备有限公司）；CX21型光学显微镜，BX51型荧光显微镜（日本奥林巴斯公司）；DNA扩增仪、DU640紫外分光光度计（美国Backman公司）；Eagle EyeⅡ凝胶成像仪（AGENE公司）；DYYⅢ2型电泳仪（北京六一仪器厂）；玻璃匀浆器（中国科大生物技术有限公司）；Speetra classic酶标分析仪（Austria公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 哮喘模型制备及标本采集 将70只大鼠随机分成空白对照组、模型组、地塞米松组［0.4 mg/（kg·d）］、桂龙咳喘宁组［10 g/（kg·d）］，平喘宁低剂量组［4.9 g/（kg·d）］、平喘宁中剂量组［9.8 g/（kg·d）］、平喘宁高剂量组［19.6 g/（kg·d）］7组，每组10只。第1天、第8天采用大鼠腹腔注射100 g/L卵蛋白生理盐水混悬液1 mL致敏。采用10 g/L卵蛋白溶液超声雾化20 min～30 min，1次/d，连续7 d，致大鼠出现点头、身颤、节律性收腹样喘促等现象，提示模型复制成功。第15天给药与诱喘同时进行，并给予寒冷刺激，连续4 w。给药采用诱喘前30 min灌胃，空白对照组、模型组每天给予等量蒸馏水灌服。末次激发1 h后，采用腹腔注射水合氯醛0.35 mL/100 g麻醉大鼠，打开胸腔，取右肺和左肺组织放入冻存管中，置-80℃冰箱中保存备用。

1.2.2 cAMP/cGMP检测 按试剂盒说明书进行，该试剂盒为酶标记免疫吸附测定法（ELISA）。利用抗原能吸附到固相载体表面的特性，使cAMP、cGMP抗体反应在固相载体表面进行，分离cAMP、cGMP抗原抗体结合物，在450 nm波长的条件下用酶标仪获取吸光度（OD值），并测算cAMP、cGMP 浓度。

1.2.3 TGF-β1mRNA测定 根据cDNA文库与相关文献［5］，引物由上海捷瑞生物工程有限公司（ISO9001：2008）设计合成。TGF-β1扩增产物长度：231 bp，Forward primer：5′-TGGTGGACCGCAACAACGCAAT-3′，Reverse primer：5′-TGGGGGTCAGCAGCCGGT TA-3′；GAPDH扩增产物长度：431 bp，Forward primer：5′-GGGGCTCTCTGCTCCTCC CTG-3′，Reverse primer：5′-AGGTGAGCCCCAGCCTTCTCC-3′。取100 mg肺组织放于匀浆管内，冰上操作，加入1 mL Trizol溶液，研磨组织后，倒入1.5 mL EP管中，混匀室温静置5 min后，每1 mL Trizol溶液中加0.2 mL氯仿，混匀室温静置5 min后，15 000 rmp离心15 min。将上层水相转入新的1.5 mL EP管中，加入0.5 mL异丙醇，混匀后置于-20℃1 h。然后12 000 rmp离心10 min，留取沉淀，加入1 mL 75%乙醇，振荡洗涤RNA沉淀1次，后7 500 rmp离心5 min，小心倒掉上清，置于超净工作台吹干沉淀，再在管中加入20 μL DEPC水溶解完全，即得大鼠肺组织总RNA。取5 μL总RNA点样于0.8%琼脂糖凝胶电泳，Eagle EyeⅡ凝胶成像仪观察电泳条带，并用DU640紫外分光光度计测算RNA260nm/280nm比值。逆转录（RT）：取2μL总RNA加10mMdNTPMix2μL、Oligo（dT）18primer 1 μL 于 100μL EP 管中，再加 Water，nuclease-free 9 μL，5×Reaction buffer 4 μL、Revert AidTMMMulvReverseTranscriptase1 μL，RiboLockTMRNase Inhibitor 1 μL于反应管中，42℃水浴60 min，70℃水浴5 min以失活逆转录酶终止逆转录反应，冰浴冷却，即得cDNA。聚合酶链式反应（RT-PCR）：先将 TGF-β1、GAPDH 两对引物稀释至浓度为10 pmol。加样依照如下体系进行：cDNA 2 μL，10 pmol Forward primer 1 μL，10 pmol Reverse primer 1 μL，nuclease free water 8.5 μL，PCR Master Mix（2×）12.5 μL，低速离心混匀。反应条件：TGF-beta1：变性 40 s，95℃；退火60℃，40 s；72℃延伸，40 s；共进行 34个循环，最后 72℃延伸7 min，扩增长度片段231 bp。GAPDH：变性 40 s，95℃；退火 60 ℃，40 s；72 ℃延伸，40 s；共进行 34个循环，最后 72℃延伸7 min，扩增长度片段431 bp。PCR产物电泳分析：分别取5 μL PCR产物与1 μL DNA加样缓冲液混匀，以1%琼脂糖凝胶电泳，同时加100 bp Marker，其结果用Eagle EyeⅡ凝胶成像仪分析：①确定产物位置；②光密度值扫描（密度代表基因表达丰度）；③半定量计算：TGF-β1mRNA表达丰度/GAPDH表达丰度。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 cAMP/cGMP检测结果

各组大鼠肺组织cAMP、cGMP含量及cAMP/cGMP比值测算如下，结果见表1。

表1 大鼠肺组织cAMP、cGMP含量参数比较 （nmol/L，）

表1 大鼠肺组织cAMP、cGMP含量参数比较 （nmol/L，）

注：与模型组比较，1）P<0.05，2）P<0.01

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由表1可知，与模型组比较，平喘宁各剂量组肺组cGMP含量降低，cAMP/cGMP升高，差异均有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）。

2.2 总RNA纯度测定

各组总 RNA 260 nm/280 nm 平均比值为 1.8～2.0［6］，表明总RNA基本无蛋白质污染与降解，RNA纯度较好。结果见表2。

表2 各组大鼠肺组织总RNA纯度比较

2.3 TGF-β1-mRNA表达丰度半定量

TGF-β1-mRNA表达丰度半定量，以GAPDH为内参，各组PCR产物采用1%琼脂糖凝胶电泳，用Eagle EyeⅡ凝胶成像仪分析。与模型组比较，平喘宁各剂量组PGF-β1-mRNA 表达率度降低，差异有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）。结果见表3，图1。

表3 各组TGF-β1-mRNA表达丰度半定量比较 （）

表3 各组TGF-β1-mRNA表达丰度半定量比较 （）

注：与空白对照组比较，1）P<0.05，2）P<0.01；与模型组比较，3）P<0.05，4）P<0.01

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3 讨论

第二信使cAMP、cGMP可能是阴阳学说的物质基础之一，具有相互拮抗制约的生物学效应。多家文献报道cGMP含量升高、cAMP/cGMP比值下降是阳虚证的表现。在肺组织中，cAMP含量上升则舒张支气管平滑肌，支气管得以扩张；与之相反，cGMP含量上升则收缩支气管平滑肌，诱发哮喘［5-7］。该实验显示模型组较空白对照组cGMP含量升高、cAMP/cGMP比值下降（P<0.01）；治疗组较模型组cGMP含量降低、cAMP/cGMP比值上升（P<0.01，P<0.05）。证明肺阳虚大鼠模型复制成功，并为平喘宁治疗寒性哮喘提供了合理性依据。

支气管哮喘是由多种炎症细胞浸润及其分泌的炎性介质与细胞因子共同参与的气道慢性炎症，支气管上皮细胞与气道平滑肌细胞（ASMC）也参与了这个炎症过程，而气道重构则是慢性哮喘反复发作的病理学基础，是气流受限甚至不可逆的主要原因，可加重气道高反应性。气道上皮下纤维化、ASMC增生与肥大是气道收缩与重构的主要病理基础。TGF-β1参与激活ERK通路，嗜酸性粒细胞、上皮细胞和巨噬细胞等细胞都可以分泌 TGF-β1［8-9］。TGF-β1结合胞膜表面受体，激活Ras-Raf-MEK-ERK通路，ERK磷酸化后转移至细胞核，与转录因子相互作用，进而影响相应基因转录，导致细胞的特异性表达。TGF-β1在促进胶原蛋白等细胞外基质在肺间质和肺泡间沉积与纤维细胞增殖中起关键作用，因此TGF-β1在哮喘发病中起重要作用。平喘宁由射干麻黄汤与三子养亲汤化裁而成，功效温肺化痰、止咳平喘、祛风解痉，主治寒性哮喘。在实验过程中，模型组、地塞米松组、平喘宁高、中剂量组各死亡1只大鼠，桂龙咳喘宁组、低剂量组死亡2只大鼠，主要在造模、灌胃给药过程中，原因可能与大鼠过敏有关。

该研究显示平喘宁能够显著降低寒性哮喘大鼠肺组织中TGF-β1RNA的表达水平，从而减轻或逆转气道重构，降低气流受限程度，这可能即是平喘宁有效治疗寒性哮喘的分子机制之一。

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