芪龙益肝方对酒精性脂肪肝大鼠肝组织细胞色素CYP2E1表达的研究

王洪海，张成博，韩 涛，杨海燕，于学美

（1.山东中医药大学，山东济南250355；2.泰山医学院，山东泰安271016）

酒精性脂肪肝是酒精性肝病最早的病理改变之一，也是饮酒所致的最常见的肝脏病变。与其他类型脂肪肝相比，酒精性脂肪肝发生肝纤维化和肝硬化的进程相对较快，发病率相对较高。早期治疗酒精性脂肪肝可以降低酒精性肝硬化的发病率，中医通过辨证施治具有独特的疗效。我们用临床治疗经验方芪龙益肝方药作用于酒精性脂肪肝大鼠，检测其对模型大鼠肝组织细胞色素CYP2E1表达的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 健康雄性Wistar大鼠50只，体重（180±20）g。由山东大学实验动物中心提供（SCXK鲁20050004）。

1.1.2 主要试剂和仪器 HP2AS-1000高清晰度彩色病理图文分析系统，CYP2E1多抗购自美国CHEMICON公司（批号：20050603）。

1.2 实验方法

1.2.1 大鼠酒精性脂肪肝模型建立 雄性Wistar大鼠50只，随机取10只作为正常对照组正常饲养，其余动物按照文献方法［1-3］造模，给予基础饲料加1%胆固醇、5%猪油、10%玉米油做成的混合饲料，另外按白酒剂量5 g/kg·次灌胃，以后每10 d根据大鼠体重、活动及反应情况增加灌酒量 1 g，最终白酒灌胃剂量达8 g/kg·次［4］。饲养8 w后，空白对照组、模型组随机各取5只采血测定CHO、TG、HDL、ALT、AST，活杀做病理组织学检查确定是否已形成酒精性脂肪肝模型。

1.2.2 分组及给药 随机将酒精性脂肪肝模型大鼠分为模型对照组、护肝片组、联苯双酯组、全方组。芪龙益肝方药由山东中医药大学药学院制剂中心提供，全方成人日用量为117 g，按体表面积比值折算，给予大鼠中剂量10.3 g/kg。护肝片由黑龙江葵花药业股份有限公司生产，批号：200408004。人日用量为12片，按体表面积折算，护肝片组大鼠给药中剂量为1.08片/kg。联苯双酯滴丸由德州德药有限公司生产，批号：040415。按体表面积折算，联苯双酯组大鼠给药的中剂量为4.05 mg/kg。以上药物按1 mL/100 g体重的体积每日早上8时灌胃给药，连续30 d。正常对照组、模型对照组灌胃等量生理盐水。除正常对照组外，其他各组继续给予高脂饲料喂食，同时给予含乙醇10%的日常饮用水。

1.3 统计学方法

应用SPSS13.0 for Windows统计软件进行统计学处理，组间比较采用方差分析。

2 结果

2.1 大鼠酒精性脂肪肝模型建立

结果见表1，图1。

表1 大鼠酒精性脂肪肝模型检测 （mmol/L，±s）

表1 大鼠酒精性脂肪肝模型检测 （mmol/L，±s）

注：与正常对照组比较，1）P<0.001，2）P<0.05

组别 T G C H O H D L A L T A S T正常对照组 0.75±0.14 1.16±0.33 1.09±0.15 46.75±8.2492.25±5.56模型组 2.25±0.40 1） 2.30±0.38 2） 0.76±0.14 1） 81.5±8.13 1） 174.75±10.27 1）

由表1可以看出，模型组 TG、CHO、ALT、AST明显增高，HDL下降，与正常对照组相比较差异均有统计学意义，提示模型成立。

图1 成模检测两组大鼠肝组织病理切片（HE染色）

由图1可以看出，正常对照组肝细胞大小一致，排列整齐，核无畸形，无明显变性、坏死和纤维化。模型对照组肝细胞肿胀，胞质内有大量脂肪空泡，细胞核变小，并且偏位。与正常对照组比较，模型对照组出现明显的脂肪变性。

2.2 芪龙益肝方对肝组织细胞色素CYP2E1表达的影响

末次给药后24 h，处死取各组大鼠肝组织，经10%中性福尔马林充分固定，常规脱水、透明，石蜡包埋，连续4 μm切片，作细胞色素p-4502E1（CYP2E1）染色。采用SABC法，切片脱蜡水化后经微波抗原修复，血清封闭，滴加1∶200兔抗鼠P-4502E1多抗。4℃冰箱过夜，DAB显色。染色过程中作阴性对照和阳性对照，阴性对照以PBS缓冲液替代一抗。将P-4502E1免疫组织化学染色切片在10倍的物镜下，选择阳性细胞较多的区域采集3～5个光镜视野，输入HP2AS-1000高清晰度彩色病理图文分析系统。统一背底和倍体，对阳性细胞占所有细胞的百分比均值进行计算机定量分析。结果表明，酒精性脂肪肝时CYP2E1表达增强。给予芪龙益肝方后CYP2E1表达减少，与护肝片组和联苯双酯组比较差异有统计学意义，结果见表2。

表2 芪龙益肝方对肝组织细胞色素CYP2E1表达的影响 （±s）

表2 芪龙益肝方对肝组织细胞色素CYP2E1表达的影响 （±s）

注：与模型对照组比较，1）P<0.001；与正常对照组比较，2）P<0.01，3）P<0.05；与护肝片组比较，4）P<0.05；与联苯双酯组比较，5）P<0.05

组别 C Y P 2 E 1表达正常对照组 0.031±0.01模型对照组 0.380±0.14 2）全方组 0.080±0.05 1）4）5）拆方组 0.150±0.07 1）3）护肝片组 0.170±0.05 1）联苯双酯组 0.180±0.10 1）

3 讨论

芪龙益肝方就是在肝气虚损、酒毒损伤的理论基础上组方，本方由生黄芪、穿山龙、玫瑰花、葛根、白术、青皮等药物组成。生黄芪甘温，入肺、脾经。功能补气，兼能升气。《医学衷中参西录》载“肝属木而应春气，其气温而性喜条达，黄芪之性温而上升，以之补肝缘同气相求之妙用”。现代药理研究证明黄芪具有保肝、抗氧化、抗肝纤维化、降脂的作用。穿山龙活血逐瘀，具有降低胆固醇、抗炎镇痛功效。葛根轻清升散，能升发脾之清气，鼓舞胃气上行。脾胃是气机升降之枢纽，能升清降浊，清阳升则浊阴自降，用葛根以升发清阳、解酒毒。白术健脾燥湿，以助脾运，培土荣木以加强黄芪补肝气之力，现代药理表明白术具有保肝、降酶、利胆、抗氧化、改善免疫的作用。玫瑰花理气解郁、和血散瘀，玫瑰花、穿山龙两药皆气味芳香，有化浊之功，以通肝络解疼痛。青皮苦辛性温，入肝、胆经。本品沉降下行，能疏肝行气，善理肝胆之滞气，尤善除痞散结、消积化滞。用其直入肝经，疏肝破气以消除积滞。诸药合用，共收补益肝气、化浊通络之功。

细胞色素P-450系统是位于滑面内质网上的一组混合功能氧化酶系，它参与内源性物质和外源性物质代谢，细胞色素P-4502E1（CYP2E1）是该系统的主要组成部分，CYP2E1是机体摄入药物和毒物（四氯化碳、乙醇、脂肪酸）的主要代谢酶。从解毒功能的角度来看，CYP2E1比其他同工酶更为重要［5］。CYP2E1在酒精性肝病的发病机制中主要参与脂质过氧化反应，与氧自由基和羟自由基的生成有关。酒精在肝细胞内通过细胞色素P4502E1并在铁离子参与下的氧化作用，会产生过多的氧应激产物，如羟自由基、超氧阴离子、过氧化氢等自由基，这些自由基可激活磷脂酶及脂质过氧化反应，降低膜磷脂，改变其通透性和流动性，从而改变与膜结合的酶、受体和离子通道的微环境，影响其功能；还可以刺激肝星状细胞分泌胶原，最终导致肝纤维化的产生［6］。CYP2E1随脂肪肝程度的加重，表达逐渐增高［7］。酒精性脂肪肝时CYP2E1表达增强。正常肝组织内，CYP2E1表达仅见于中央静脉区，主要表达于肝腺泡Ⅲ区，在乙醇、药物或其他毒物的作用下Ⅰ区或Ⅱ区CYP2E1表达。给予芪龙益肝方后CYP2E1表达减少，与护肝片组和联苯双酯组比较差异有统计学意义。抑制CYP2E1在Ⅰ区或Ⅱ区的表达可能是芪龙益肝方治疗酒精性脂肪肝的作用机制之一。

［1］厉有名，夏维新.脂肪肝现代诊疗［M］.南京：江苏科学技术出版社，2003：65.

［2］于学美，韩涛，崔西泉，等.补益肝气方药对酒精性脂肪肝模型大鼠 TNF-α 含量的影响［J］.泰山医学院学报，2007，28（11）：841.

［3］于学美，韩涛，张成博，等.补益肝气方药对酒精性脂肪肝模型大鼠的治疗效应［J］.泰山医学院学报，2007，28（4）：241.

［4］孙怡宁，尚荣军.白酒灌胃法建立大鼠早期酒精性肝病模型［J］.陕西医学杂志，2002，32（6）：565.

［5］戴军，陆伦根，曾民德.肝细胞色素P-4502E1在实验性肝纤维化组织中的表达［J］.肝脏，2000，5（1）：16.

［6］戴宁，曾民德,彭延申.复方中药对酒精性脂肪肝肝细胞色素P4502E1 表达的影响［J］.中华肝脏病杂志，2003，11（11）：658.

［7］史洪涛，陈东风，熊仁平.肝细胞色素P-4501A1、2E1在非酒精性脂肪肝发病中的作用［J］.中华消化杂志，2004，24（6）：360.