原发性高血压患者血浆一氧化氮和红细胞内皮型一氧化氮合酶的改变

郑昆 马秦岭

(武警河南总队卫生处 郑州 450001)

原发性高血压(essential hypertension)是一种常见心血管疾病,其发病与遗传和环境因素有关,但具体发生机制尚不清楚。内源性一氧化氮(nitric oxide,NO)是由左旋精氨酸(L-Arg)在一氧化氮合成酶(nitric oxide synthase,NOS)的作用下产生的,是一种化学性质活跃的气体自由基,亦是一种重要的生物信号分子。在心血管系统中,NO具有扩张血管,抑制血小板黏附和聚集,抑制血管平滑肌细胞和淋巴细胞增殖,以及影响心脏舒缩周期和收缩力等功效。研究表明,NO与高血压发生密切相关[1]。Kleinbongard等[2]在红细胞浆膜上发现了内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS),表明红细胞也是心血管系统内NO的主要来源之一。本研究拟观察原发性高血压患者红细胞eNOS蛋白表达量和活性,以及血浆中NO含量的变化,以探讨红细胞eNOS-NO系统在高血压发生中的可能作用。

1 对象与方法

1.1 研究对象

研究对象分为对照组和高血压组。对照组:我院体检正常,且无心血管疾病家族史的老人,其中男11人,女9人,年龄(59.6±7.7)岁。高血压组:高血压诊断标准按1999年WHO高血压指南定义的标准确诊。选择原发性高血压患者20例,其中男13例,女7例,年龄（62.3±8.8）岁。

1.2 血样采集及红细胞制备

实验前48h内受试者均未服任何药物。受试者于清晨(6∶30～7:30)静卧15min,空腹,肘静脉采血5mL。所有血液样品均加入38g/L枸橼酸钠(体积比1∶9)抗凝,1400g离心10min,去上清。加入4倍体积Hank’s平衡盐溶液(MHBSS)中反复离心3遍,清洗后取红细胞悬浮于等体积Hank’s平衡盐溶液中待测。

表1 各组血浆NO2-/NO3-含量、羟自由基含量及红细胞eNOS活性比较(±s)

表1 各组血浆NO2-/NO3-含量、羟自由基含量及红细胞eNOS活性比较(±s)

注:与对照组比较,*P<0.05,**P<0.01

血浆NO2-/NO3-含量(µmol/L)红细胞eNOS活性(U/mg)羟自由基(KU/L)对照组 88.37±5.71 39.82±4.15 192.15±22.31高血压组 (65.30±6.95)* (25.64±4.51)** (285.40±34.46)**

1.3 血浆NO2-/NO3-含量、羟自由基含量及红细胞eNOS活性测定

依照试剂盒(南京建成生物公司)说明,紫外分光光度计测量红细胞eNOS活性,自动生化分析仪测定血浆NO2-/NO3-含量和羟自由基含量。

1.4 Western blot法测定红细胞eNOS蛋白表达

制备红细胞组织匀浆,考马斯亮蓝法测定蛋白含量。蛋白样品经15% SDS-PAGE分离转移于PVDF膜。一抗(Santacruz公司)孵育过夜,HRP标记二抗(TBD公司)孵育1h,ECL显影。采用凝胶系统分析软件扫描各条带灰度值,以对照组运动前条带为100%,其它各条带与其比值,即其相对表达量(%)。Actin作为内参蛋白。

1.5 统计方法

所有数据均用SPSS 15.0统计软件包进行处理,结果用平均数±标准差表示,各组比较采用单因素方差分析,P<0.05为显著性水平,P<0.01为非常显著水平。

2 研究结果

2.1 各组血浆NO2-/NO3-含量、羟自由基含量及红细胞eNOS活性比较

高血压组NO2-/NO3-含量和红细胞eNOS活性均低于正常对照组,羟自由基含量高于正常对照组,且差异均具有显著性意义,分别为P<0.05和P<0.01,见表1。

2.2 各组红细胞eNOS蛋白表达水平变化

如图1所示,高血压组红细胞eNOS蛋白表达水平相对于对照组降低了26%,差异具有显著性意义(P<0.01)

3 讨论

图1 各组红细胞eNOS蛋白表达水平变化

在心血管系统中,NO自由扩散到邻近的血管平滑肌细胞内,与细胞膜上的鸟苷酸环化酶结合,使GTP转化为cGMP,后者促进Ca2+内流,从而引起血管平滑肌舒张。NO的基础合成对血管张力和血压的调节具有非常重要的作用,抑制NO的合成可使健康人的血压升高。此外,NO亦可通过cGMP途径水平增高抑制血小板的聚集,从而抑制动脉内血栓形成及冠心病的发生[3]。本研究中,我们发现高血压患者血浆NO2-/NO3-含量显著低于对照组。其他研究亦发现,自发性高血压大鼠及高血压患者血清NO水平下降,血管舒张功能障碍[4]。这表明NO与高血压的形成和发展有着密切的关系。高血压患者血浆NO含量降低可能与降解增加有关。本研究中,我们发现,高血压组血浆羟自由基水平明显高于对照组。研究表明,高血压患者中性粒细胞及单核细胞内的氧自由基活跃增强,而抗氧化酶活性减弱,氧自由基可与NO结合成ONOO-而直接灭活NO,使其生物活性丧失[5]。Janega等[6]研究表明,高血压大鼠给予外源性SOD和过氧化氢酶补充,可增加NO水平,从而保护内皮细胞功能并松弛血管平滑肌。

高血压患者NO水平降低除了与破坏增加有关,还与其生成减少有关。NOS是调节NO合成的关键酶,已确认有3种同工酶:神经元型(nNOS)、内皮型(eNOS)和诱导型(iNOS),它们分布的部位、生物效应及调控机制各不相同[7]。研究表明,心血管系统NO主要是由血管内皮细胞中内皮型一氧化氮合成酶(eNOS)催化合成。研究证实eNOS亦存在于红细胞浆膜,且在正常情况下参与循环系统约30%的NO供应[2]。本研究中,高血压组红细胞eNOS表达量降低了26%,其活性亦降低了36%。Fischer等在体外循环中发现,高血流切应力可显著激活红细胞中eNOS,但高频反复的高血流切应力可抑制eNOS的活化[8]。此外,Pistea等[9]报道,高血压患者中的高血流切应力使红细胞膜蛋白质的脱失与降解明显增加,这可能与本研究中高血压组红细胞eNOS表达量降低有关。高血压患者外周血管阻力增大,因而血流切应力明显升高,从而损伤红细胞eNOS-NO合成系统的生物学作用。NO产生减少进一步抑制血管舒张,从而继续提高血流切应力,破坏红细胞、血小板、内皮细胞内的NO合成系统,从而形成恶性循环,这可能是高血压形成的一个机制。

本研究首次观察了原发性高血压患者红细胞eNOS-NO合成系统变化规律,结果表明,高血压患者血浆NO减少可能与氧自由基破坏增加以及红细胞eNOS-NO合成系统受损有关,提示外源性补充抗氧化剂及诱导红细胞eNOS表达可能有益于高血压的治疗。

[1]Gkaliagkousi,E,S.Douma,C.Zamboulis,et al.Nitric oxide dysfunction in vascular endothelium and platelets:role in essential hypertension[J].J Hypertens,2009,27:2310～2320.

[2]Kleinbongard,P,R.Schulz,T.Rassaf,et al.Red blood cells express a functional endothelial nitric oxide synthase[J].Blood,2006,107:2943～2951.

[3]Pilon,M,R.Wu,J.E.Huot-Marchand,et al.Effect of chronic inhibition of nitric oxide on hypertension,insulin resistance,and cardio-vascular remodeling in glucose-fed rats[J].J Cardiovasc Pharmacol,2009,53:405～413.

[4]Pechanova,O,L.Jendekova,S.Vrankova.Effect of chronic apocynin treatment on nitric oxide and reactive oxygen species production in borderline and spontaneous hypertension[J].Pharmacol Rep,2009,61:116～122.

[5]Yoshioka,H,S.Asai,M.Yoshioka,et al.Molecular mechanisms of generation for nitric oxide and reactive oxygen species,and role of the radical burst in plant immunity[J].Mol Cells,2009,47:18～26.

[6]Janega,P,S.Kojsova,L.Jendekova,et al.Indapamide-induced prevention of myocardial fibrosis in spontaneous hypertension rats is not nitric oxide-related[J].Physiol Res,2007,56:825～828.

[7]Jin,Q,T.Z.Zhang,W.M.Chen,et al.Preventive effect of endothelial nitric oxide synthase gene transfer on chronic hypoxic pulmonary hypertension in rats[J].Zhongguo Wei Zhong Bing Ji Jiu Yi Xue,2009,21:222～225.

[8]Fischer,U.MR.Schindler,K.Brixius,et al.Extracorporeal circulation activates endothelial nitric oxide synthase in erythrocytes[J].Ann Thorac Surg,2007,84:2000～2003.

[9]Pistea,A.,E.N.Bakker,J.A.Spaan,et al.Small artery remodeling and erythrocyte deformability in L-NAME-induced hypertension:role of transglutaminases[J].J Vasc Res,2008,45:10～18.