三七皂甙Rg1对脂多糖诱导的大鼠肝细胞损伤的防护作用

李剑瑜 刘毅 高波 戴富林 武凡

现在广泛认为脂多糖（liposaccharide，LPS）是导致脓毒血症、败血症休克的直接原因，并可导致多功能不全综合征（multi organ dysfunction syndrome，MODS）发生，而肝脏则是MODS最早受损和受损最为严重的脏器［1，2］。由于缺乏简便有效的治疗药物，对MODS的治疗至今未取得突破性的进展。三七皂甙Rg1是中国传统中草药三七的单体成分，其对急性肝损伤的作用和保护机理，目前鲜见报导。本实验用透射电镜、DNA凝胶电泳、单细胞凝胶电泳法（single cell gel electrophoresis assay，SCGE，又称慧星电泳）探讨LPS所致肝细胞损害的特点，并探讨三七皂甙Rg1抗肝细胞损害的作用及作用机理，为急性肝细胞损伤的治疗决策提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

LPS、胶原酶Ⅳ、percoll均购自sigma公司；triton x－100购于Furka公司，三七皂甙Rg1为昆明植物研究所产品。

1.2 实验动物

Wistar大鼠32只，体重（200±12）g。

1.3 实验方法

1.3.1 肝细胞分离与纯化 胶原酶原位灌流法分离大鼠肝细胞，参照文献［3］进行。取Wistar大鼠32只，随机分为4组，每组8只，胶原酶原位灌流法分离大鼠肝细胞后用台盼蓝排除试验检测肝细胞存活率＞90%，计算细胞浓度，调整细胞数为106个／ml。于正常对照组、LPS组、LPS＋Rg1组、LPS＋Quinacrine组分别加入20mmol／L PBS、3mg／L LPS、3mg／L LPS＋20mmol／LRg1、3mg／L LPS＋5μmol／L Quinaceine，于施加因素后0、2、4、6、8、12小时分别收集肝细胞和肝细胞培养液进行各指标测定。

1.3.2 透射电镜观察 肝细胞收获后，离心弃上清，PBS漂洗三次，2%戊二醛液固定，1mol／L二甲砷酸缓冲液漂洗，1%四氧化锇固定，丙酮系列脱水，环氧树脂包埋，切片染色后观察。

1.3.3 DNA 片段的提取 参照文献［4］提取培养肝细胞的DNA片段，经空气干燥后，溶于20μl的双蒸水中，4℃保存。用于DNA梯度电泳。

1.3.4 SCGE检测 参照文献［3］并加以改进。于45℃，100μl 1%正常熔点琼脂糖的无Ca2＋、Mg2＋PBS悬液浇注到磨粗的Dakin载玻片上将纯化后的肝细胞进行固化成三层。然后将玻片置水平电泳槽液面下0.25cm，在碱性电泳缓冲液中放置20分钟后25V，300mA，电泳20分钟。用0.4mol／L Tris（pH 7.5）浸洗，每次15分钟，共3次，然后用溴化乙锭水溶液染色。染色后的单个肝细胞应尽快在荧光显微镜下观察。

1.4 统计学分析

统计软件为SPSS 17.0统计软件包。SCGE玻片用CM－2000B彩色医用图像分析系统分析。数据用±s表示，并经正态性检验以及方差齐性检验。凋亡与坏死的时相性变化相关分析采用pearson's检验。Rg1对大鼠肝细胞损害的抑制作用数据采用方差分析和组间q检验。

2 结果

2.1 肝细胞形态学变化

大鼠肝细胞在加入LPS（终浓度3mg／L）后培养2小时，透射电镜下观察，图1可见较早期调亡的肝细胞。染色质固缩聚集于核膜，呈境界分明的块状或新月状，在上方可见一个较小的凋亡小体。图2可见正在形成凋亡小体的肝细胞，该细胞胞质浓缩，细胞周围有大小不等的凋亡小体。

图1 LPS处理2小时后肝细胞凋亡的电镜检测（×6000）

图2 LPS处理2小时后肝细胞凋亡的电镜检测（×3500）

2.2 DNA梯度电泳

各组大鼠肝细胞在加入施加因素后于4小时后提取细胞DNA，在1.5%的琼脂糖上电泳，35V，电泳2小时，泳道1为marker，泳道2和3为LPS组，泳道4为LPS＋Rg1组、泳道5为LPS＋Quinacrine组，泳道6为正常对照组，泳道2和3均出现典型的梯状条带，说明有明显的凋亡现象，泳道4和泳道5的条带颜色较浅，说明凋亡细胞明显减少，而泳道6对照组无此现象，说明没有凋亡细胞（见图3）。

图3 DNA梯度电泳

2.3 单细胞凝胶电泳检测

在通常情况下，DNA双链以组蛋白为核心。盘旋形成核小体。在核小体中DNA为负超螺旋结构。如果有去污剂进入细胞，核蛋白被浓盐提取，DNA便形成残留的类核，镜下可见荧光强度较强的图形头部，无拖尾，为正常细胞（见图4A）。如果类核中DNA断裂，就会在核外形成一个DNA晕轮，DNA断裂将引起超螺旋松散，电泳时DNA断裂片向阳极伸展，形成特征性慧星（见图4C）。细胞凋亡时DNA在质膜损伤以前断裂，这种断裂很容易被这种方法显示，被称为“凋亡之慧星”。凋亡慧星的数量可以代表凋亡细胞的数量。在慧星电泳中，坏死细胞由于细胞膜受损，DNA随机断裂，形成没有明显头部的拖尾（见图4B）。因为慧星电泳能将正常细胞、凋亡细胞和坏死细胞定量地区分开来，所以更有利于凋亡的深入研究。原代培养肝细胞于各培养皿中加入处理因素后培养0、2、4、6、8、12小时进行电泳。图4为电泳2小时的各组细胞，对照组为正常细胞（见图4A），而LPS组为凋亡细胞（见图4C），坏死细胞（见图4B）。

图4 单细胞凝胶电泳检测

由表1可见用SCGE法检测LPS诱导肝细胞损害的时相性变化，6小时内凋亡细胞数增加较快，8小时后坏死细胞数急剧增加，12小时坏死细胞占绝大多数。

由表2可见三七皂甙Rg1明显抑制LPS所致的肝细胞凋亡与坏死，其效果与凋亡抑制剂Quinacrine无明显差异。

表1 用SCGE法检测LPS诱导肝细胞凋亡与坏死的时相性变化（n＝8，±s，%）

表1 用SCGE法检测LPS诱导肝细胞凋亡与坏死的时相性变化（n＝8，±s，%）

注：凋亡细胞与处理时间的相关性r＝0.971，P＜0.01；坏死细胞与处理时间的相关性r＝0.941，P＜0.01。

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表2 Rg1对LPS诱导的原代培养8小时大鼠肝细胞损害的抑制作用（n＝8，±s）

表2 Rg1对LPS诱导的原代培养8小时大鼠肝细胞损害的抑制作用（n＝8，±s）

注：与正常对照组细胞相比aP＜0.01；与LPS组相比b P＜0.01。

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3 讨论

已知认为肝脏是LPS导致受损最为严重的器官［1，2］，但受损的性质和机制尚存在争议［5］，更缺乏有效的治疗药物。三七皂甙具有抗炎、抗氧化、抗衰老作用，但对急性肝细胞损伤的作用机理尚未见报导。在本实验中，用LPS（3mg／L）处理原代培养肝细胞2小时，电镜可见典型的凋亡细胞和凋亡小体。DNA凝胶电泳也表现明显的凋亡梯度，用SCGE检测发现LPS（3mg／L）处理2小时肝细胞即可得到凋亡细胞为7.2%±2.6%，坏死细胞为10.2%±2.4%，提示LPS引起的肝损害的性质及严重程度。这说明LPS可以直接诱导肝细胞凋亡与坏死。LPS引起的肝细胞损害的时相性变化，至今也未见报导，本资料用改进的SCGE法做进一步探讨发现LPS引起的肝细胞凋亡与坏死都有显著的时相性变化。

SCGE也叫慧星电泳，是一种直接显示单个细胞DNA损伤的微电泳技术［2，6］。但SCGE鲜见应用于肝细胞损伤研究的报道。由于SCGE能将正常细胞、凋亡细胞和坏死细胞定量地区分开，而且敏感性高、方法简便、价格便宜，因而可以成批的检测标本，SCGE比起昂贵的1995年Vermas首次使用的Annexinv／pI法定量分析凋亡细胞与坏死细胞显示了更多的优越性，所以有利于肝损害的研究。用SCGE检测原代培养肝细胞，加3mg／L LPS 2小时可以观察到明显的肝细胞凋亡与坏死，这比最近报导的使用LPS 10mg／L 4小时发现凋亡细胞与坏死细胞敏感的多［6］。表1显示在8小时之内凋亡细胞与坏死细胞的增加与处理时间有明显的相关性，到12小时凋亡细胞数急剧下降，而坏死细胞数从第8小时迅速上升，于12小时占绝大多数。本资料提示LPS诱导的肝脏损害是一个从肝细胞凋亡到坏死的过程。这一过程可能是细胞死亡连锁反应的不同阶段，其原因可能在于虽然凋亡与坏死是细胞死亡的两种不同形式，但两者不是毫无关联的。它们之前的交错在于无论哪种死亡形式，最终都伴有能量不足、大分子物质的降解以及自由基的形成［4］，另一方面同一种诱导因素，如本实验中刺激因素LPS，由于时间的不同而导致连锁反应的两个阶段。

本资料用SCGE法表明LPS诱导的肝细胞损害的存在以及严重程度，因此寻找有效的特异治疗MODS的药物成为笔者进一步研究的焦点。Quinacrine可以抑制肝损害，但考虑到Quinacrine的作用有脏器选择性及效应多样性，该药在进入治疗急性肝损伤前，仍有许多向题尚未解决［3，4］。在国外学者把MODS称为介质病，在用介质疗法显得苍白无力的时候［3］，本课题组用灵敏度高、价格便宜的SCGE对中药进行筛选。研究发现具有抗炎、抗氧化、抗衰老作用的三七皂甙单体Rg1对急性肝损害有明显抑制作用，显著地抑制肝细胞凋亡与坏死，在治疗急性肝损伤有着Quinacrine不可替代的优越性，预示其应用的广泛前景。

总之，本资料提示SCGE法是研究肝细胞损害并进行药物筛选的良好方法。用该法笔者发现LPS诱导的肝细胞损害是一个从肝细胞凋亡到坏死的过程，并证实三七皂甙Rg1为肝细胞损害的有效的保护剂，深化了对MODS的认识，为MODS的治疗提供新的思路。

［1］武凡，张树三，康格非.三七皂甙对肝纤维化大鼠分泌型磷脂酶A2和肿瘤坏死因子表达的影响［J］.中华肝脏病杂志，2003，11（1）：51－52.

［2］褚丽萍，刘强，王芹，等.线粒体DNA 4977bp缺失和彗星分析评价肿瘤细胞的辐射敏感性［J］.中华放射医学与防护杂志，2008，28（2）：142－145.

［3］Relja B，Schwestka B，Lee VS，et al.Inhibition of C－Jun N－terminal kinase after hemorrhage but before resuscitation mitigates hepatic damage and inflammatory response in male rats［J］.shock，2009，32（5）：509－516.

［4］Croner RS，Hohenberger W，Jeschke MG.Hepatic gene expression during endotoxemia［J］.J Surg Res，2009，154（1）：126－134.

［5］王东吉，武凡.三七皂甙单体Rb1对大鼠脑缺血再灌注时脑细胞凋亡及cPLA2蛋白表达的影响［J］.中国康复医学杂志，2007，22（5）：414－415.

［6］Greulich KO.Photons bring light into DNA repair：The comet assay and laser microbeams for studying photogeno toxicity of drugs and ageing［J］.J Biophotonics，2011，4（3）：165－171.