补肾解毒活血法对骨髓抑制小鼠造血功能的影响

赵静梅 杨旭辉 王广占 窦永起

化疗是恶性肿瘤治疗的主要手段之一，但由于化疗引起的骨髓抑制限制了化疗用药剂量和治疗节奏，影响了治疗效果，并容易引起严重感染、出血等并发症，严重影响患者生存质量并威胁患者生命。近年来出现的各种细胞集落刺激因子，虽然具有见效快、有效率高、应用普遍等优点，但费用高昂、副作用多、效果不持久。中医学多将化疗后骨髓抑制归于脾肾两虚、气血不足［1，2］，临床多以益气补血为主要的治疗方法，但疗效还不尽理想。笔者在多年临床实践中体会到在补肾基础上配合解毒活血药效果会更好，但其作用机制不明，相关的实验研究也罕有报道。本实验观察了补肾解毒活血法对环磷酰胺诱发骨髓抑制的影响，并对其作用机理作了初步探讨。

1 材料

1.1 动物

SPF级昆明种小鼠60只，雌雄各半，体重18～22g，由军事医学科学院实验动物中心提供，常规饲养，动物合格证号：SCXK（军）2007－004，生产条件许可证：SYXK（军）2007－004。

1.2 主要试剂与仪器

MethoCult®03534培 养 基 和 MethoCult®03334培养基（加拿大StemCell Technologies公司）；电热恒温培养箱：DH4000A（天津泰斯特）；超净工作台（北京昌平空气净化公司）；Napco－5410 CO2细胞培养箱（shelden公司）；光学显微镜OLYMPUS（日本）；Sysmex－820自动血细胞计数仪（日本）；注射用环磷酰胺，产品批号10012621，规格0.2g（江苏恒瑞医药股份有限公司）。

1.3 中药

补肾解毒活血中药由熟地10g、何首乌10g、肉苁蓉10g、苦参10g、白花蛇舌草10g、川芎15g、当归10g、丹参15g组成，共计90g／d。按《中药药理研究方法学》［3］计算小鼠的等效剂量为0.36g·kg－1·d－1。以上药物均由解放军总医院中药房提供，经鉴定后，水煎、过滤、浓缩、配制成含生药1g／ml的药液，置4℃保存备用。

2 方法

2.1 模型制作

小鼠常规饲养3天适应环境后，观察无异常者，于次日按100mg／kg剂量腹腔注射环磷酰胺，连续3天，制成骨髓抑制模型小鼠。

2.2 分组与给药

实验分空白对照组、模型组、中药治疗组。造模完成后次日开始灌胃给药，中药治疗组给予补肾解毒活血中药汤液，空白对照组和模型组分别给予等体积的生理盐水，连续10天。

2.3 外周血细胞分析

每组随机抽取10只，于造模前1天及造模后第1、3、5、7、10、14 天，每 只 实 验 小 鼠 尾 静 脉 取 血20μl，用Sysmex－820自动血细胞计数仪检测外周血细胞。

2.4 骨髓有核细胞计数及造血祖细胞培养

制模后第11天，颈椎脱臼处死小鼠，剥取股骨，用6号针头以PBS冲出骨髓细胞，再用4号针头过滤制成单个骨髓细胞悬液，在显微镜下按白细胞计数法进行骨髓有核细胞计数。按文献方法［4］进行集落培养，检测小鼠骨髓粒细胞－巨噬细胞集落生成单位（CFU－GM）、红细胞爆裂型集落生成单位（BFU－E）、定向体外红系集落形成单位（CFU－E）的生成能力。

2.5 统计学处理

运用SPSS 17.0统计学软件统计，各组实验数据以均值±标准差（±s）表示。组间的差异显著性分析用F检验。

3 结果

3.1 补肾解毒活血汤对血虚小鼠外周血象的影响

外周血白细胞（WBC），模型组在造模后第1天降到最低点，与空白对照组相比差异有非常显著性意义（P＜0.01），造模后第3天仍低于空白对照组，至第5天恢复正常，但在第7天时出现明显高于正常组的“反跳”现象，而中药治疗组在造模后第3天虽低于空白对照组（P＜0.01），但明显高于模型组（P＜0.01），第5天恢复正常且保持稳定。见表1。

外周血血小板（PLT），模型组在造模后第5天降到最低然后回升，至第10天达到正常，而中药治疗组自第3天即开始回升，第7天时即与空白对照组持平，且其最低值明显高于模型组（P＜0.01）。见表2。

各组红细胞变化不明显，故省略表。

3.2 补肾解毒活血法对骨髓抑制小鼠骨髓有核细胞计数和造血祖细胞集落的影响

结果显示模型组小鼠BMNC和CFU－GM、CFU－E、BFU－E计数较空白对照组均明显减少（P＜0.01），经补肾解毒活血中药汤液治疗后，小鼠BMNC计数和 CFU－GM、CFU－E、BFU－E较模型组明显增多（P＜0.01）。

4 讨论

机体造血主要依靠造血祖细胞来扩增。造血祖细胞在多种造血因子的调控下进一步增殖分化 ，不断发育形成各种成熟血细胞［5］。当受到化学药物等损伤时，即会发生造血功能障碍，其主要原因之一是杀伤了赖以维持造血功能的造血干／祖细胞［6］，这是化疗药引起骨髓造血功能下降及外周血细胞减少的主要原因。各种血细胞对化疗药物的敏感性取决于它们的半衰期长短［7］。白细胞半衰期最短6小时，故最易受到抑制，引起白细胞减少；血小板半衰期为5～7天，亦较易引起减少；而红细胞半衰期长达120天，因此红系祖细胞数目减少常不易从外周血红细胞中表现出来。

表1 补肾解毒活血法对环磷酰胺致骨髓抑制小鼠外周血WBC的影响（±s，n＝10，109／L）

表1 补肾解毒活血法对环磷酰胺致骨髓抑制小鼠外周血WBC的影响（±s，n＝10，109／L）

注：与空白对照组比较aP＜0.05，b P＜0.01；与模型组比较c P＜0.05，d P＜0.01。

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表2 补肾解毒活血法对环磷酰胺致骨髓抑制小鼠外周血PLT的影响（±s，n＝10，109／L）

表2 补肾解毒活血法对环磷酰胺致骨髓抑制小鼠外周血PLT的影响（±s，n＝10，109／L）

注：与空白对照组比较aP＜0.05，b P＜0.01；与模型组比较c P＜0.05，d P＜0.01。

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表3 补肾解毒活血法对造血祖细胞集落形成及骨髓有核细胞计数的影响（±s，n＝10）

表3 补肾解毒活血法对造血祖细胞集落形成及骨髓有核细胞计数的影响（±s，n＝10）

注：与空白对照组比较aP＜0.05，b P＜0.01；与模型组比较c P＜0.05，d P＜0.01。

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中医学认为血液的生成与心、脾、肾等多脏腑有关，其中与肾的关系最为密切。因肾藏精，主骨生髓，精髓化生血液。即《景岳全书》中“肾为水脏，主藏精而化血”。《张氏医通》中亦有“血之源头出于肾”之说。因此补肾法是临床常用的治疗化疗后骨髓抑制的方法。但临床上单用补肾法治疗常难以获得预期疗效，结合该病的临床表现和临床治疗经验，笔者认为化疗药物为热毒之品，邪毒内侵，热毒内蕴，瘀阻骨髓脉络，导致气血瘀滞，因此在补肾法的基础上结合解毒和活血法治疗本病，才能达到邪去而元气自复，瘀去而气血畅通的效果。方中熟地甘温，补血养阴，填精益髓，善补肾阴，为补肾阴之要药，《本草纲目》称其能“填骨髓，长肌肉，生精血，补五脏内伤不足”，何首乌补肝肾、益精血，治血虚萎黄。《本草纲目》谓其能养血益肝、固精益肾。肉苁蓉甘温助阳，为补肾阳、益精血之良药，三药平补肾之阴阳，药性平和，为补肾之良药。苦参苦寒，能清热燥湿解毒，白花蛇舌草也有较强的清热解毒作用，清除蕴积于体内的邪热和毒邪。川芎活血行气为血中之气药，当归补血活血，丹参活血调经，祛瘀止痛，即“一味丹参散，功同四物汤”。三药活血化瘀而生新，共同达到治疗骨髓抑制的效果。

表1、表2表明，中药治疗组可以促进 WBC的恢复，且相对于模型组来说其恢复过程较稳定；效果更为明显的是，中药治疗组血小板降低幅度小、持续时间短，因而提示补肾解毒活血法尤其能提高环磷酰胺所致骨髓抑制情况下的血小板再生。表3表明，环磷酰胺可以引起红系、粒系造血功能的下降，但由于红细胞半衰期长达120天，本实验外周血中未出现明显变化，而补肾解毒活血法可显著升高BFU－E、CFU－E和 CFU－GM 集落产率，从而促进红系和粒单系造血能力的恢复。这可能是其治疗化疗后骨髓抑制的有效环节。

本实验还发现，该种造模方法动物恢复快，引起的骨髓抑制持续时间短，而由于中药作用时间长、起效慢，因而难以很好地反映出中药防治化疗后骨髓抑制的比较优势；另一方面，由于红细胞半衰期长达120天，本实验中未出现明显变化，临床上反复化疗而引起的贫血也未出现，故有必要考虑进一步改进造模方法。

综上所述，本实验结果提示补肾解毒活血法治疗骨髓抑制可通过增加骨髓造血祖细胞数量，从而促进环磷酰胺致骨髓抑制小鼠外周血 WBC、PLT的稳定恢复。

［1］刘启华，王旭 .益气补血汤治疗化疗后白细胞减少89例疗效观察［J］.中国中医药科，2007，14（6）：447.

［2］苗文红 .补肾健脾法治疗肿瘤放化疗后骨髓抑制98例［J］.陕西中医，2000，21（7）：289.

［3］陈奇 .中药药理研究方法学［M］.北京：人民卫生出版社，1996：11103.

［4］刘秀珍 .造血祖细胞培养技术实验手册［M］.北京：北京出版社，1993：25.

［5］牛泱平，陈小红，宋必卫，等 .人参二醇、三醇皂苷对小鼠骨髓造血干／祖细胞体外增殖的影响［J］.中国药理学通报，2004，20（11）：1316－1317.

［6］邹仲敏，孙慧勤，罗成基.6Gyγ射线照射诱导骨髓造血细胞凋亡［J］.中华放射医学与防护杂志，1998，18（6）：390－392.

［7］刘新春，程玉峰，李德爱 .实用抗肿瘤药物治疗学［M］.北京：人民卫生出版社，2002：1078.