黄芪建中汤对脾气虚肺癌小鼠免疫功能及cyclin D1基因表达的影响*

包素珍 张爱琴 孙在典 宋 红 李恒楠

（1.浙江中医药大学，浙江 杭州 310053；2.浙江省肿瘤医院，浙江 杭州 310022；3.浙江省中医院，浙江 杭州 310006）

现代研究发现黄芪建中汤可减轻放化疗后的毒副反应，有明显的抗氧化作用，抑制组织中表皮生长因子及表皮生长因子受体的过度表达进而抑制肿瘤的发生［1］。cyclin D1为目前公认的癌基因，其过度表达时使细胞周期G1/S期转换时间缩短，导致细胞增殖失控，从而发生癌变。为进一步明确黄芪建中汤对免疫功能的影响及抑制肿瘤发生的作用机制，本实验通过建立脾气虚Lewis肺癌模型，研究黄芪建中汤对脾气虚肺癌小鼠免疫功能及cyclin D1基因表达的影响。

1 材料与方法

1.1 动物与瘤株 C57BL/6小鼠60只，雌性，体质量（20±2）g，购于上海医学科学院实验动物中心。饲养于浙江中医药大学实验动物中心清洁级动物房。小鼠Lewis肺癌瘤株，购于上海医学科学院实验动物中心。

1.2 药物 黄芪建中汤由芍药18 g，桂枝9 g，炙甘草6 g，生姜9 g，大枣4枚，饴糖30 g，黄芪9 g组成。药材购自浙江中医药大学门诊部中药房，按《中药药理研究方法学》计算小鼠低、中、高剂量的等效剂量分别为：8.1、16.2、32.4 g/kg体质量，分别为成人剂量的6、12、24倍，按常规方法煎成汤剂，配制成生药含量分别为 0.324、0.648、1.296 g/mL 的药液。

1.3 试剂及仪器 D-木糖试剂盒，南京建成生物工程研究所；胃泌素放免试剂盒，北京北方生物技术研究所；白细胞介素（IL）-2 ELISAKIT试剂盒，上海晶美生物工程有限公司；cyclin D1引物，上海生工生物工程技术服务有限公司；TGL-16B台式高速离心机，上海安亭科学仪器厂；UV2000紫外分光光度计，美国UNICO公司；2400型PCR仪，英国TECHNE公司产品；GIS-2008凝胶成像系统，上海天能科技有限公司；UR-4100型酶标仪，美国Dynaech公司。

1.4 造模方法 用C57小鼠60只常规饲养2 d适应环境后，取20只小鼠正常饲养，其余40只小鼠采用苦寒泻下法造脾气虚模型（以100 g大黄∶600 mL蒸馏水的比例，于50℃水浴中浸泡8 h，可得大黄浸泡液400 mL。每只小鼠每日灌胃1 mL，连续9 d。从第5日起，小鼠表现为便溏、纳少、倦卧、懒动、消瘦、拱背、精神萎糜等症状。第10日分别测正常组和模型对照组各10只小鼠血清木糖浓度及胃泌素水平，验证脾气虚模型成功。脾气虚模型建成后，正常组取10只和模型对照组40只小鼠接种肿瘤：在无菌条件下取接种14 d的新鲜无坏死Lewis癌块组织，制成单细胞悬液，0.9%氯化钠注射液调整浓度至6×106个/mL，取0.2 mL癌细胞原液，接种于小鼠的左腋下皮下。从取出肿瘤到移植完最后1只小鼠时间控制在2 h之内。

1.5 分组与给药 C57BL小鼠接种24 h后，随机分为6组，每组10只。正常组、肿瘤对照组、模型对照组给以灌胃0.9%氯化钠注射液0.5 mL，每日1次，黄芪建中汤低、中、高剂量组分别给以低、中、高的黄芪建中汤0.5 mL灌胃，每日1次。连续14 d。

1.6 标本采集与检测 观察小鼠的体质量、饮食、行动、精神食欲、行动状态、毛色、皮毛的光泽度等全身情况。给药结束后第2日称体质量，眼球后取血，检测血清木糖浓度及血清胃泌素水平；脱颈椎处死小鼠，无菌剥取瘤块，保存于液氮中，RT-PCR法检测cyclin D1的表达。

1.7 统计学处理 应用SPSS13.0统计软件。计量资料用（±s）表示，计量资料两组间比较用t检验，多组间比较用one-way方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 脾气虚Lewis肺癌小鼠模型建立 见表1。从建立脾气虚模型第5日起，小鼠表现为便溏、纳少、倦卧、懒动、消瘦、拱背、精神萎靡等症状。造模第10日球后取血，检测血清木糖浓度及胃泌素含量均低于正常，与正常组比较，差异非常显著 （P＜0.01）（见表1）。同时在小鼠左腋下接种Lewis肺癌瘤株，小鼠于接种后第7～10日腋下出现大小不等的肿块，以模型对照组较明显；第15日处死小鼠，取血检测血清木糖浓度及胃泌素水平验证脾气虚模型仍存在，提示小鼠脾气虚Lewis肺癌模型复制成功。

表1 不同组别小鼠血清血清木糖、胃泌素水平比较（±s）

表1 不同组别小鼠血清血清木糖、胃泌素水平比较（±s）

与正常组比较，**P＜0.01。

组 别 n 血清木糖（mmol/L） 血清胃泌素（pg/mL）正常组 10 3.21±0.32 33.56±3.51模型对照组 10 2.09±0.24** 27.14±0.19**

2.2 各组小鼠瘤质量及抑瘤率比较 见表2。实验结果显示黄芪建中汤各剂量组瘤质量均减轻，与模型对照组比较，差异显著（P＜0.05），以高剂量组抑瘤效果最佳（P＜0.01）。

2.3 各组小鼠脾指数和胸腺指数比较 见表3。本实验结果显示：黄芪建中汤中、高剂量组脾指数、胸腺指数增加显著，与模型对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.05或0.01）。

表2 各组小鼠瘤质量及抑瘤率比较（±s）

表2 各组小鼠瘤质量及抑瘤率比较（±s）

与模型对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。下同。

组 别 n 瘤质量（g） 抑瘤率（%）肿瘤对照组 10 3.72±0.47 -模型对照组 10 3.82±0.83 -黄芪建中汤低剂量组 10 3.32±0.46* 13.09黄芪建中汤中剂量组 10 2.98±0.24* 21.99黄芪建中汤高剂量组 10 2.34±0.34** 38.74

表2 各组小鼠脾指数及胸腺指数比较（±s）

表2 各组小鼠脾指数及胸腺指数比较（±s）

组 别 n 脾指数（mg/g） 胸腺指数（mg/g）正常组 10 18.14±1.38 2.89±0.35肿瘤对照组 10 13.24±1.94 1.96±0.70模型对照组 10 12.31±0.79 1.75±0.45黄芪建中汤低剂量组 10 14.50±3.16 2.01±0.29黄芪建中汤中剂量组 10 15.31±2.59* 2.32±0.53*黄芪建中汤高剂量组 10 17.28±2.85** 2.54±0.60**

2.4 各组小鼠肿瘤组织中cyclin D1-mRNA/GAPDH的基因表达比较 见表4，图1。黄芪建中汤中、高剂量组cyclin D1-mRNA/GAPDH表达下降，以高剂量组最为显著，与模型对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.01）。

表4 各组小鼠肿瘤组织cyclin D1-mRNA/GAPDH表达比较（±s）

表4 各组小鼠肿瘤组织cyclin D1-mRNA/GAPDH表达比较（±s）

组 别 n cyclin D1/GAPDH肿瘤对照组 10 0.73±0.09模型对照组 10 0.96±0.15黄芪建中汤低剂量组 10 0.95±0.24黄芪建中汤中剂量组 10 0.66±0.17黄芪建中汤高剂量组 10 0.62±0.11**

图1 各组cyclin D1基因、GAPDH基因表达

3 讨 论

cyclin D1是G1期细胞周期素，主要作用是促进细胞通过G1/S检查点，cyclin D1对细胞周期G1期的调控是通过对抑癌基因蛋白pRb的调控实现的。pRb通过信号传递促进cyclin D1基因表达［2］。G1/S调控点是细胞周期中最重要的调控点，决定细胞周期的时间。cyclin D1过度表达是导致G1/S期检测点缺陷主要原因。检测点功能缺陷可能会导致遗传基因突变和染色体结构异常的细胞获得增殖，从而导致肿瘤发生［3］。肿瘤是一种细胞周期性疾病，cyclin D1作为细胞周期重要的正调控因子在肿瘤的发生发展过程中起着重要的作用［4-6］。

中医学认为“脾为后天之本，气血生化之源”，有防御外邪侵害并自我恢复的作用。现代医学证明，其和机体免疫功能有着密切的联系。如李艳等［7］对ConA、LPS诱导T、B淋巴增殖反应，可使大黄煎液建立的脾虚小鼠不同程度地提高其体液免疫功能。杜雅薇等［8］研究发现中药组可不同程度提高大黄致脾虚泄泻的SIgA、IL-2。而IL-2是最主要、最强有力的T细胞生长因子，并且可诱导或促进多种细胞毒细胞活性，如自然杀伤细胞（NK）、细胞毒性T淋巴细胞（CTL）、淋巴因子激活的杀伤细胞（LAK）细胞，这些细胞在机体的免疫监视免疫方面至关重要。王红伟等［9］发现脾虚机体的红细胞C3b-受体花环率（C3b-RR）和T淋巴细胞转化率明显降低，而Ic-RR明显升高，提示红细胞介导的消除循环免疫复合物及免疫黏附功能下降，从而导致脾虚时免疫功能的低下，淋巴细胞亚群比例的失调，这在脾虚型恶性肿瘤患者中的表现较为明显。

肺癌病位在肺，病机为阴阳不和，病本为正气不足。癌着于身，易走窜耗伤气血所致恶病质居多。在中医范围内又属虚劳范畴。黄芪建中汤出自《金匮要略·血痹虚劳》“虚劳里急，诸不足，黄芪建中汤主之”，药用黄芪、桂枝、芍药、炙甘草、生姜、大枣、饴糖组成，功能在于燮理阴阳，培补脾气，使谷气充足，正气旺盛。本实验提示黄芪建中汤组均有升高脾指数、胸腺指数的作用，并降低cyclin D1/GAPDH水平。黄芪建中汤抑制肿瘤的机理之一可能是改善脾气虚肺癌小鼠的免疫功能、下调肿瘤组织cyclin D1-mRNA的表达。

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