PEP－1介导铜锌超氧化物歧化酶对帕金森病小鼠氧化应激损伤的保护作用

陈 涛 贾 佳 叶 飞 汪 健 王世凤 周少华

尽管帕金森病（Parkinson’s Disease，PD）的病因尚不完全明确，但自由基的形成和氧化应激在其发病机制中发挥了重要作用这一观点已经取得了共识［1］。氧自由基（oxygen free radicals，OFR）包括超氧阴离子（.O－2），OH，H2O2，它参与生物分子反应，使不饱和脂肪酸生成脂质过氧化物（LPO），后者对蛋白质和DNA产生氧化损伤，导致细胞变性死亡，而超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）是清除细胞内自由基，保护细胞免受氧化应激损伤的关键酶之一，但外源性SOD受到了血脑屏障的阻碍而限制了其应用。利用基因工程技术合成的PEP－1－铜、锌超氧化物歧化酶（PEP－1－Cu，Zn－superoxide dismutase，PEP－1－SOD1）与单纯SOD1比较，其穿透生物膜或者血脑屏障的能力得到很大程度的提高［2］，为利用SOD1治疗与氧自由基产生过多的疾病提供了新的途径。目前已有PEP－1－SOD1对脑缺血神经保护的实验研究，但其对PD模型的影响尚未见报道。本实验主要观察PEP－1－SOD1对PD模型小鼠的行为学、纹状体铜、锌超氧化物歧化酶（SOD1）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH－Px）及丙二醛（MDA）含量的影响，探讨其对PD模型有无神经保护作用及其机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物分组及试剂

36只雄性C57／BL小鼠，10月龄，体重（30±2）g，购于武汉大学医学院动物中心，并随机分为正常组、模型组及PEP－1－SOD1组各12只。MPTP购自Sigma公司；SOD1、GSH－Px、MDA 试剂盒购自南京建成生物工程研究所。PEP－1－SOD1蛋白购自湖北医药学院附属人民医院临床研究所。

1.2 PD模型制备及给药

PEP－1－SOD1 组 给 予 500μg／kgPEP－1－SOD1腹腔注射，1次／d，模型组和正常组给予等量生理盐水腹腔注射，连续3 d。参照文献［3］，第4天开始PEP－1－SOD1组和模型组小鼠腹腔注射 MPTP（30 mg／kg），连续注射5 d，正常组腹腔注射等量生理盐水。

1.3 行为学检测与取材

1.3.1 爬杆实验（Pole test）参照文献［3］，将一根直径10 cm、高50 cm木棍垂直竖立，测试小鼠放置在其顶部，记录其沿杆爬下过程中所需时间。每只小鼠连续测量3次，取其均数。

1.3.2 行为学测试结束后将小鼠麻醉后脱臼处死，快速取视交叉前部脑组织，分离出左右侧纹状体后立即置于－80冰箱内保存。

1.4 SOD1、GSH－Px活性及 MDA含量检测

取小鼠纹状体剪碎制成悬液倒入匀浆管中，并加入冷的0.86%生理盐水0.3 ml进行充分匀浆。将匀浆液以4 000 r／min离心15 min后取上清液待测。SOD1活性测定：黄嘌呤氧化酶催化黄嘌呤反应产生超氧阴离子，超氧阴离子可将反应体系中的轻胺氧化生成亚硝酸盐，加入显色剂之后溶液呈现紫红色，在550 nm波长条件下测定得到吸光值。但是，当含有SOD1酶的样品加入反应体系之后反应产生的超氧阴离子被SOD酶清除，从而造成紫红色的亚硝酸盐生成量减少，溶液吸光度降低，SOD1酶活力越高，则测定管的吸光值越低，根据测定管及对照管吸光值的变化关系可以计算得到SOD1酶的活力。GSH－Px活性测定：用反映体系中谷胱甘肽（GSH）的减少量反应GSH一Px酶的活力。样品中的GSH在GSH－Px的催化下与H2O2反应生成氧化型谷胱甘肽（GSSG），通过测定样品中GSH的消耗量，计算得到GSH－Px酶的活力。MDA含量测定：MDA能够与硫代巴比妥酸（TBA）发生缩合，生成的产物为红色，在波长532 nm测定的吸光度值可以反映出样品中MDA含量的高低。

1.5 统计学处理

应用SPSS 13.0软件包，组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差，以P＜0.05认为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 3组小鼠行为学测试

注射MPTP后可以看到模型组大鼠协调能力显著下降，表现为反应迟钝、肌肉僵硬、攀爬能力差、出现明显平衡障碍，模型组所需时间为（15.62±0.93）s，较对照组（4.54±0.54）s明显延长（t＝22.95，P＜0.01）。与模型组比较，PEP－1－SOD1组小鼠行为异常程度明显减轻，攀爬能力和运动平衡性较前者好，所需时间（7.86±0.84）s明显缩短（4.54±0.54）s（t＝13.78，P＜0.01）（图1）。

图1 3组小鼠爬杆实验（±s）

2.2 3组小鼠纹状体组织SOD1、GSH－Px活性及MDA含量的比较

如图2所示，模型组纹状体SOD1活性为（17.52±1.03）U／mg prot，同对照组SOD1活性为（31.84±0.92）U／mg prot比较明显下降 （t＝26.53，P＜0.01），PEP－1－SOD1组纹状体SOD1活性为（23.74±1.23）U／mg prot，明显高于模型组（t＝21.39，P＜0.01）。与对照组（26.48±0.86）U／mg prot比较，模型组GSH－Px活性（18.05±0.62）U／mg prot显著降低（t＝18.37，P＜0.01），而PEP－1－SOD1组 GSH－Px 活 性 （22.21±0.67）U／mg prot与模型组比较明显升高（t＝13.19，P＜0.01）。

如图3所示，对照组 MDA含量为（7.75±0.54）nmol／mg prot，模 型 组 为 （11.62±1.32）nmol／mg prot较对照组明显升高（t＝9.75，P＜0.01），而PEP－1－SOD1组 MDA含量（8.26±0.59）nmol／mgprot较模型组明显下降（t＝13.92，P＜0.01）。

图2 3组小鼠纹状体SOD1、GSH－Px活性比较（±s）

图3 3组小鼠纹状体MDA含量比较（±s）

3 讨 论

氧化应激产生大量的氧自由基诱导神经元死亡被认为是导致PD黑质细胞死亡病理机制的重要因素［3］。MPTP穿过血脑屏障后形成 MPP＋，MPP＋可抑制酪氨酸羟化酶的活性而减少多巴胺的合成，还可以抑制活性复合体（NADH脱氢酶），增加自由基的生成及氧化应激，引起多巴胺能神经元的凋亡［4］。Zhang等用 MPTP作用于 Cu，Zn－SOD或者GSH－PX基因敲除的小鼠，发现其黑质多巴胺能神经元缺失明显高于基因正常小鼠［5］。临床研究显示，PD患者黑质中过氧化物比正常人明显增多，纹状体中 GSH 水 平、GSH－Px的 活 性 显 著 降 低［6，7］，而GSH－Px和SOD是体内最主要的自由基清除酶物质。GSH－Px广泛地存在于机体内，能特异地催化还原型谷胱甘肽（GSH）对过氧化氢的还原反应，可以起到保护细胞膜结构和功能完整的作用［8］。

SOD1是细胞中高水平表达的SOD，是SOD的主要形式，在清除体内氧自由基中发挥着重要作用。但SOD1这种生物大分子在生物体内无特异受体和通道，也不能依靠内吞作用等入胞方式进入细胞内。研究显示，细胞穿透肽PEP－1可与SOD1进行融合，使得SOD1的细胞转导能力得到显著提高［9］。在短暂性前脑缺血和脑梗死动物模型中可以观察到融合蛋白能穿透血脑屏障，使受损的神经元存活能力显著增加，发挥了神经保护作用［10，11］。

本实验结果表明，MPTP腹腔注射后小鼠的行为明显异常，纹状体SOD1、GSH－Px活性显著下降，MDA水平明显升高，而给予PEP－1－SOD1处理后明显减轻了帕金森病小鼠行为异常，并且可以使其纹状体的SOD1和GSH－Px活性明显升高，MDA含量明显降低。这表明PEP－1－SOD1自由基清除作用较强，能有效减轻脂质过氧化，降低MDA含量，具有神经保护作用。

综上所述，本研究观察到氧化应激在MPTP诱导帕金森病小鼠模型中发挥了重要作用。PEP－1－SOD1可减轻其氧化应激损伤、提高机体抗自由基损伤功能，改善小鼠行为学障碍，表现出了明显的神经保护作用，但有无其他机制参与仍需大量和深入的研究。

1 Jenner P.Oxidative stress in Parkinson’s disease.Ann Neurol，2003，53（suppl 3）：S26－S38.

2 Cho JH，Hwang IK，Yoo KY，et al.Effective delivery of PEP－1－cargo protein into ischemic neurons and long－term neuroprotection of PEP－1－SOD1 against ischemic injury inthe gerbil hippocampus.Neurochem Int，2008，52（4）：659.

3 段冷昕，李瑞芳，金 瑾，等.黄连解毒汤对MPTP所致帕金森病小鼠的防治作用.中国老年学杂志，2010，7（30）：2004－2006.

4 Nikolaos P，Ioannis P，George Z，et al.Thiol redox state and oxidative stress in midbrain and striatum of weaver mutant mice，a genetic model of nigrostriatal dopamine deficiency.Neuroscience Letters.2005，376（1）：24－28.

5 Smeyne RJ，Jackson－Lewis V.The MPTP model of Parkinson＇s disease.Mol B rain Res，2005，134（1）：57－66.

6 Zhang J，Graham DG.Montine TJ，et al.Enhanced N－methyl－4－phenyl－1，2，3，6－tetrahydropyridine toxicity in mice deficient in CuZn－superoxide dismutase or glutathione peroxidase.Neuropathol Exp Neurol，2000，59（1）：53－61.

7 Eriksen，JL，Dawson，TM.Dickson DW，et al.Caught in the act：alpha－synuclein is the culprit in Parkinson＇s disease.Neuron，2003，40（3）：453－456.

8 Filipov NM，Norwood AB，Sistrunk SC.Strain－specific sensitivity to MPTP of C57BL／6 and BALB／c mice is age dependent.Neuroreport，2009，20（7）：713，717.

9 袁 红，梁立武，刘 军，等.氧化应激与帕金森病多巴胺神经元死亡.武警医学，2007，18（6）：448－450.

10 Eum WS，Kim DW，Hwang IK，et al.In Vivo Protein Transduction：Biologically Active Intact Pep－1－Superoxide Dismutase Fusion Protein Efficiently Protects Againtst Ischemic Insult.Free Radic.Biol，2004，37（10）：1656－1669.

11 董 敏，席刚明，张正洪.PEP－1－SOD1预处理对脑梗死后小鼠海马神经元的保护.重庆医学，2010，39（12）：1487－1488.