P16 INK4a蛋白及人乳头瘤病毒检测对宫颈癌前病变的预测价值

金 艳，曹树军，杨道华，施华珍，钱金风

P16 INK4a蛋白及人乳头瘤病毒检测对宫颈癌前病变的预测价值

金 艳，曹树军，杨道华，施华珍，钱金风

目的 探讨P16 INK4a蛋白及人乳头瘤病毒 (HPV)DNA对检测宫颈癌前病变的预测价值。方法 收集2008年11月—2011年10月在上海交通大学医学院附属第一人民医院松江分院经细胞学筛查、阴道镜活检、组织病理学诊断为宫颈上皮内瘤变 (CIN)，并根据病变程度和患者意愿行宫颈锥切治疗的705例患者作为研究对象。分析P16 INK4a蛋白及HPV DNA检测对疾病的预测价值。结果 P16 INK4a蛋白阳性率在CINⅢ中高于HPV DNA阳性率(χ2=8.78，P＜0.05)，且P16 INK4a蛋白的阳性率与病变程度呈正相关 (r=0.258，P＜0.05)，而HPV病毒阳性率与病变程度呈负相关 (r=0.530，P＜0.05)。结论 P16 INK4a蛋白比HPV DNA对检测CINⅢ具有更高的敏感性，所以HPV DNA联合P16 INK4a蛋白检测对CIN有更高的预测价值。

宫颈上皮内瘤样病变;治疗;人类乳头病毒;P16 INK4a蛋白

宫颈细胞巴氏涂片 (PAP)及液基薄层细胞检测 (TCT)目前已普遍应用于宫颈癌筛查，尤其PAP已普遍应用于发展中国家，且90%的宫颈癌是由人乳头瘤病毒 (HPV)导致，如何更好地检测HPV是多年来医学界一直探讨的问题。Miriam等［1］研究认为:单凭PAP检查敏感度还不很高，应增加HPV DNA检测，但HPV DNA感染的短暂性导致HPV DNA的诊断率也很低，而P16 INK4a蛋白在HPV感染后转变中存在高表达，所以应结合P16 INK4a蛋白检测增加其敏感度。在细胞学样本中结合P16 INK4a蛋白组织学检查增加诊断宫颈上皮内瘤变 (CIN)的敏感度。有研究显示，宫颈细胞学检查异常后接受阴道镜检查的人群中，免疫组织化学P16 INK4a蛋白在高级别病变中阳性率高［2］。本研究选择2008—2011年在我院经阴道镜检查诊断为CIN同时又接受宫颈锥切 (LEEP)手术治疗的患者，对其P16 INK4a蛋白及HPV DNA检查结果进行探讨，研究两者对宫颈癌前病变的诊断价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2008年11月—2011年10月在上海交通大学医学院附属第一人民医院松江分院经细胞学筛查、阴道镜活检、组织病理学诊断为CIN，并根据病变程度和患者意愿行LEEP治疗的705例患者为研究对象;年龄20～69岁，平均(39.5±9.8)岁。其中CINⅠ:378例、CINⅡ:219例、CINⅢ:108例 (包括原位癌6例)。

1.2 方法

1.2.1 宫颈组织HPV DNA检测 应用荧光定量PCR检测仪对组织标本进行HPV DNA定性检测，HPV DNA 16、18型检测按照试剂盒说明书进行操作。检测样本Ct值＜38为阳性。

1.2.2 P16 INK4a蛋白检测 取病理存档腊块组织标本，采用EnVision免疫组化二步法检测组织标本中的P16 INK4a蛋白情况。试剂由上海长岛生物技术有限公司提供，严格按照说明书要求由专业人员进行操作。

1.2.3 免疫组化结果判定 P16 INK4a蛋白阳性为胞核/胞质棕黄色颗粒着色。每张切片选取10个高倍镜 (×400)视野，计数每500个细胞中阳性细胞数的均值，依据其阳性率和染色强度判断结果。阴性:阳性细胞数＜10%或染色强度与背景颜色无明显差异;阳性:阳性细胞数≥10%。

1.2.4 统计学方法 应用SPSS 11.5统计软件进行统计学分析。HPV DNA感染阳性指标以检出率表示，P16 INK4a蛋白阳性染色以阳性率表示，计数资料采用χ2检验，等级资料采用Spearm相关性分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 P16 INK4a蛋白阳性率在CINⅢ中高于HPV阳性率 (χ2=8.78，P＜0.05，见表1)，且P16 INK4a蛋白的阳性率随着病变程度的加重而升高，呈正相关 (r=0.258，P＜0.05)，而HPV病毒阳性率随着病变程度加重而下降，呈负相关 (r=－0.530，P＜0.05)。

2.2 CINⅢ病理符合率均较CINⅡ与CINⅠ高，差异有统计学意义 (χ2=7.58，χ2=5.87;均P＜0.05，见表2)。

表1 治疗前各病变程度HPV DNA及P16 INK4a蛋白的阳性率比较Table 1 Comparison of positive rate of the lesion level HPV DNA and P16 INK4a before treatment

表2 HPV DNA及P16 INK4a蛋白检测结果的病理符合率Table 2 Pathological coincedence rate of test results in HPV DNA and P16 INK4a

3 讨论

3.1 PAP涂片对宫颈癌的预防有很大帮助，然而细胞学检查也存在错误读片率，从而降低了60%～70%的敏感度，假阴性结果对宫颈病变的漏诊及治疗造成很大影响［3］，高危型HPV DNA病毒筛查有利于减少假阴性率。虽然妇女生殖道感染高危型人乳头状瘤病毒 (hr－HPV DNA)较细胞学检查具有更高敏感度，但因为它不能区别HPV DNA短暂性或转换性感染，敏感度仍旧很低。结合生物标志物检查会增加其敏感度，预防过度治疗［4－5］。目前研究结果表明，P16 INK4a蛋白在高级别病变中存在高敏感度，克服了由于PAP检测缺点及HPV DNA检测作为HPV DNA短暂性及转变性。Szarewski等［6］通过分析以往资料显示，P16 INK4a蛋白对感染过HPV DNA的转换中CIN具有更高敏高度，且高达81%～100%。

3.2 P16 INK4a蛋白的表达与宫颈病变密切相关 采用免疫组化法检测P16 INK4a蛋白可广泛运用于细胞学检查，同时进一步区分未明确意义的不典型鳞形细胞 (ASCUS)中具有病变的细胞，Nieh等［7］同样依靠P16 INK4a蛋白在非典型腺细胞 (AGC)中的表达发现更加严重的病变从而得出相同的结论。P16 INK4a蛋白可作为细胞学诊断的一个生物学标记，这与Liu等［8］的研究结论一致，认为P16 INK4a蛋白蛋白细胞学中的表达能够增加诊断的敏感性和特异性。P16 INK4a蛋白基因是迄今发现的第1个直接作用于细胞周期、抑制细胞分裂的基因。P16 INK4a蛋白基因的缺失、突变和甲基化存在于多种人肿瘤细胞，提示其与肿瘤的发生、发展密切相关［9］。在宫颈癌的研究中，P16 INK4a蛋白基因在宫颈癌中的表达与其抑癌基因形象并不相符，P16 INK4a蛋白蛋白在宫颈癌中呈高表达［3－4］。目前P16 INK4a蛋白与宫颈癌关系的研究，已成为近年来宫颈癌的研究热点。P16 INK4a蛋白在宫颈上皮细胞恶性转化前已出现，并随着宫颈癌前病变级别进展而增加。有研究认为，P16 INK4a蛋白在HPV DNA感染阳性的子宫颈鳞癌中有很高的阳性表达率，可以诱导P16 INK4a蛋白的过度表达并使其具有永生性的特点，P16 INK4a蛋白过度表达可能直接或间接由HPV DNA病毒编码蛋白E6和E7所诱导，它们可以与P53和PRB结合并使其活性下降最终导致宫颈覆盖上皮发生恶变［7］，P16 INK4a蛋白已经被推算作为评价CIN及宫颈癌一个可靠的标志［10］。

3.3 当前在宫颈病变的治疗中，一个误区是将CINⅠ均认为是癌前病变，进行积极治疗。不少学者认为2002年制定的美国阴道镜和宫颈病理学会 (ASCCP)方案存在对CINⅠ的过度治疗。近年来大量临床资料证实，CIN未经治疗即有较高的自然消退率，CINⅠ60%～90%在2年内逆转，而且癌变的几率极低［8，11］。因此，对于无症状、细胞学为ASCUS和低度鳞状上皮内病变 (LSIL)，即使转化区不可见，也不用颈管刮宫，也不必锥切或LEEP，建议严格随访。CINⅠ患者可于随访观察，CINⅡ患者观察的可行性可作为今后研究方向，避免患者进行不必要的治疗，尤其是有生育要求的患者，HPV DNA结合P16 INK4a蛋白检测对CIN诊断及治疗很大帮助。

3.4 阴道镜作为随访检查的主要手段发现，结合HPV DNA及P16 INK4a蛋白检查，能更好的预测宫颈癌前病变及治疗后的随访［12］，在今后的治疗预测和观察中，可通过细胞学检查同时将P16 INK4a蛋白检测结合阴道镜作为重要的检测指标，可避免不必要的创伤性检查及治疗。

综上，CINⅠ采取LEEP手术存在过度治疗倾向;CINⅡ中发现病理升级率低，也可进行随访观察，作为今后研究方向;CINⅢ行宫颈锥切是目前主要治疗手段。HPV DNA联合P16 INK4a蛋白检查能更好的预测宫颈内瘤样病变。

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2 del Pinoa M，Rodriguez－ Carunchiob L，Alonsoa I，et al.Clinical，colposcopic and pathological characteristics of cervical and vaginal highgrade lesions negative for HPV DNA by Hybrid Capture［J］.Gynecol Oncol，2011，122(3):515 －520.

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4 Mayrand MH，Duarte－Franco E，Rodrigues I，et al.Human PAP illomavirus DNA versus PAP anicolaou screening tests for cervical cancer［J］.N Engl J Med，2007，35(7):1579－1588.

5 Reuschenbach M，Clad A，von Knebel Doeberitz C，et al.Performance of P16 INK4a－cytology，HPV DNA mRNA，and HPV DNA testing to identify high grade cervical dysplasia in women with abnormal screening results［J］.Gynecologic oncology，2010，119(1):98 －105.

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7 Nieh S，Chen SF，Chu TY，et al.Expression of P16 INK4a in PAP smears containing atypical glandular cells from the uterine cervix［J］.Acta Cytol，2004，48(2):173 －180.

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10 Lesnikova I，Lidang M，Hamilton － Dutoid S，et al.P16 INK4a as a diagnostic marker of cervical neoplasia:a tissue microarray study of 796 archival specimens［J］.Diagnostic pathology，2009，4(1):22.

11 曹树军，钱金风，朱凌，等.宫颈锥切术对阴道镜检查临床应用的再评价［J］.中国妇幼保健，2008，23(17):749－753.

12 Wen JZ，Ying L，Hua LF，et al.The value of P16 INK4a expression by fluorescence in situ hubridization in triage for high risk HPV DNA positive in cervial cancer screening ［J］.Gynecologic Oncology，2011，120(3):84－88.

Value of Immunocytochemical Staining of P16 INK4a Protein Combined with Human Papillomavirus Test for the Detec-tion of Cervical Intraepithelial Neoplasia

JIN Yan，CAO Shu－jun，YANG Dao－hua，et al.Department of Obstetrics and Gynecology，Songjiang Hospital Affiliated to Shanghai Jiaotong University School of Medcine，Shanghai 201600，China

ObjectiveTo evaluate the value of immunocytochemical staining of P16 INK4a protein combined with human papillomavirus(HPV)test for detecting cervical intraepithelial neoplasia(CIN).Methods Totally 705 patients with pathologically confirmed CIN in our hospital from November 2008 to October 2011 were enrolled in this study.We made a retrospective study of the clinical and pathological data by immunocytochemical staining of P16 INK4a protein combined with HPV test.ResultsThe sensitivity of the positive rate of P16 INK4a in high－grade CIN was significantly higher than that of HPV DNA test(χ2=20.642，P ＜0.05).The positive rate of P16 INK4a protein staining was positively correlated with the pathologic degree of lesions(χ2=38.432，P ＜0.05)，while the positive rate of P16 INK4a test was positively correlated with the pathologic degree(r=0.2580，P＜0.05)the positive rate of HPV DNA test was negatively correlated with the pathologic degree(r=－0.530，P＜0.05).ConclusionThe immunocytochemical staining of p16 INK4a protein has a higher sensitivity than HPV DNA test in detecting high grade CIN，and therefore it，when combined with HPV DNA test，has a high predictive value for CIN.

Cervical intraepithelial neoplasia;Treatment;Human papilloma virus(HPV DNA);P16 INK4a immunostaining protein

R 711.74

A

1007－9572(2012)10－3368－03

10.3969/j.issn.1007－9572.2012.10.054

上海市松江区医学领先专业建设资助项目 (05－Ⅰ－04);上海市松江区科技攻关项目

201600上海市，上海交通大学医学院附属第一人民医院松江分院妇产科 (金艳，曹树军，施华珍，钱金风)，病理科(杨道华)

曹树军，201600上海市，上海交通大学医学院附属第一人民医院松江分院妇产科;E－mail:shujun－cao@163.com

2012－02－23;

2012－09－10)

(本文编辑:李晨)