芎芪合剂对大鼠脑缺血再灌注后自由基损伤相关指标的影响*

张新春 黄 燕

（广东省中医院，广东 广州 510120）

在脑缺血性损伤机制中，自由基连锁反应被认为是造成脑组织损害的重要机制之一，缺血后再灌注可促发自由基的连锁反应，加重缺血性损伤，造成严重的神经元坏死［1］。抑制自由基的产生及自由基清除对缺血再灌注损伤具有保护作用。本实验应用益气活血中药（芎芪合剂）对脑缺血-再灌注损伤大鼠模型进行干预，从其对大鼠缺血脑组织中氧自由基损伤相关指标的影响来探讨芎芪合剂的作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物 SPF级成年雄性SD大鼠30只，体质量250～300 g，由广州中医药大学实验动物中心提供。

1.2 仪器与试剂 包括眼科剪、组织剪、玻璃分针、钢尺、刀柄、刀片、眼科镊（弯）、无齿镊、持针器、小角针、手术线、无菌弯盘、纱布、棉球、渔线、酒精灯、手术台、手术灯等。超氧化物岐化酶（SOD）试剂盒、丙二醛（MDA）试剂盒，均由南京建成生物工程研究所提供。

1.3 药物 芎芪合剂，规格为 10 mL/支，呈棕黄色，澄清透明，由黄芪总皂苷 1.0 g、芍药总苷 0.90 g、磷酸川芎嗪 0.10 g 溶于9 mL注射用水，以1%NaOH调节pH至8，定容至10 mL得浓缩药液，相当于生药：蒙古黄芪50 g，赤芍 30 g，川芎10 g，由广东省中医院制剂室提供。

1.4 模型制备 参照Koizumi［2］方法制成大鼠大脑中动脉缺血-再灌注模型。术后2 h观察大鼠的症状和体征，参照Zealonga评定神经功能缺损程度的5级4分法标准［3］，0分为无神经功能缺损症状；1分为轻微神经功能缺损，不能完全伸展左侧前爪；2分为中度局灶性神经功能缺损，向左侧转圈；3分为重度局灶性神经功能缺损，向左侧倾倒；4分为不能自发行走，意识水平下降。评分在1～3分为造模成功，纳入实验。假手术组可出现同侧Horner征，但无左侧肢体瘫痪。

1.5 分组及给药 将大鼠用随机数字表法随机分成假手术组，模型组，芎芪合剂组，每组10只。栓塞后1.5 h各组开始给药：（1）假手术组、模型组腹腔注射生理盐水 2 mL/200 g；（2）芎芪合剂组腹腔注射中药稀释液2 mL/200 g，为临床用量10倍（以临床用量200 mg/70 kg计）。栓塞后2 h拔出线栓形成再灌注。芎芪合剂组再灌注12 h后腹腔注射芎芪合剂稀释液2 mL/200 g，假手术组、模型组再灌注12 h后腹腔注射生理盐水2 mL/200 g。

1.6 标本采集与检测 在缺血2 h再灌注24 h评分后，各组大鼠断头取脑，完整剥取脑组织，用冷生理盐水将表面的血液冲洗干净，去除嗅球、小脑和低位脑干，取右侧（缺血侧）脑组织用于制作匀浆液。脑组织置于玻璃匀浆器中，加入9倍量的冷生理盐水，手工匀浆，充分研磨3～5 min，使组织匀浆化，将制备好的10%匀浆用离心机于4℃，3000 r/min离心15 min，取上清液于-75℃冰箱中保存待测。以上所有手工操作均在冰盘上进行。

1.6.1 SOD含量测定 将10%脑匀浆用生理盐水稀释成1%的组织匀浆，4 ℃，4000 r/min 离心 10 min，取上清30 μL，采用黄嘌呤氧化酶法测定SOD含量，按试剂盒说明操作。

1.6.2 MDA含量测定 用硫代巴比妥酸（TBA）比色法测定。将10%脑匀浆于 4℃，4000 r/min离心 10 min，取上清 100 μL，采用TBA比色法测定MDA含量，按试剂盒说明操作。

1.7 统计学处理 应用SPSS13.0统计软件。数据以（±s）表示，数据进行单因素方差分析，然后用posthoc检验中的LSD法（方差齐时）或Dunnett’s T3（方差不齐时）作多个均数间的两两比较。检验水准α=0.05，双侧检验。

2 结 果

2.1 一般情况 假手术组大鼠精神状态良好，毛色正常。模型组和芎芪合剂组术后出现精神萎顿，倦怠嗜唾，四肢蜷缩，活动性差，对外界敏感性下降，自发活动减少，毛色光泽暗淡，舌质明显绛紫或暗淡等。提示大鼠在脑缺血再灌注后出现了类似于脑梗死“气虚血瘀”的病理状态［4］。

2.2 芎芪合剂对MCAO再灌注后大鼠脑组织中SOD含量的影响 见表1。模型组大鼠缺血侧脑组织中SOD含量较假手术组降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；芎芪合剂组大鼠缺血侧脑组织中SOD含量较模型组提高，差异有统计学意义（P＜0.05），提示芎芪合剂能提高大鼠缺血侧脑组织中SOD含量，并使之趋向于正常。

表1 各组大鼠缺血2 h再灌注24 h SOD、MDA含量比较（±s）

表1 各组大鼠缺血2 h再灌注24 h SOD、MDA含量比较（±s）

与芎芪合剂组比较，△P＜0.05；与模型组比较，▲P＜0.05。

组 别 n SOD（U/mg） MDA（nmol/mg）假手术组 10 146.88±21.54▲ 3.41±1.29▲模型组 10 87.81±19.51△ 5.06±1.48△芎芪合剂组 10 137.50±42.51▲ 3.68±1.33▲

2.3 芎芪合剂对MCAO再灌注后大鼠脑组织中MDA含量的影响 见表1。模型组与假手术组比较差异有统计学意义 （P＜0.05），提示脑缺血2 h再灌注24 h后，模型组大鼠缺血侧脑组织中MDA含量增高；芎芪合剂组与模型组比较差异有统计学意义（P＜0.05），提示芎芪合剂组大鼠缺血侧脑组织中MDA含量较模型组减低；芎芪合剂组与假手术组比较差异无统计学意义 （P＞0.05），提示芎芪合剂能降低大鼠缺血侧脑组织中MDA含量，并使之趋向于正常。

3 讨 论

脑脉瘀阻是脑梗死发病过程中的关键病理机制，血运重建再灌注治疗可在短时间内“袪除瘀阻”，迅速恢复脑部血液供应，但在治疗后极易出现脑缺血-再灌注损伤的情况。依据黄燕教授的临床经验，脑梗死血运重建治疗后脑缺血-再灌注损伤以气虚、血瘀为主要病机，因此，益气活血法是脑缺血-再灌注损伤主要治疗法则。本研究所用药物即是根据导师的经验思路，采用益气活血的治疗原则，选取黄芪、赤芍、川芎的有效部位：黄芪总苷、赤芍总苷、川芎嗪组成芎芪合剂，以期能够减轻大鼠脑缺血-再灌注损伤的程度。

人体正常代谢也产生自由基。但体内存在相应的自由基清除酶，如SOD等，产生与清除间动态平衡，不发生自由基连锁反应和组织损伤［5］。但在脑缺血、外伤等病理条件下，清除酶活性降低，自由基产生增多，动态平衡严重破坏，则可启动自由基连锁反应，造成缺血损伤进一步加重。脂质过氧化代谢产物MDA的含量可以反映机体受自由基攻击的程度。而SOD是体内主要自由基清除酶，能够有效地清除并终止超氧阴离子引发的连锁反应［6］。MDA显著升高，说明脑组织缺血后氧自由基脂质过氧化反应增强；SOD下降可能是增强的脂质过氧化反应消耗了过多的抗氧化酶，氧化-抗氧化平衡被打破。因此，SOD和MDA含量的变化可间接反映自由基在体内的生成和体内抗氧化防御作用的功能状况。

从本实验结果表明，脑缺血2 h再灌注24 h后，模型组大鼠缺血侧脑组织中SOD含量降低；芎芪合剂能提高大鼠缺血侧脑组织中SOD含量，并使之趋向于正常。而脑缺血2 h再灌注24 h后，模型组大鼠缺血侧脑组织中MDA含量增高；芎芪合剂能减低大鼠缺血侧脑组织中MDA含量，并使之趋向于正常。以上结果提示，在脑缺血再灌注损伤的过程中，芎芪合剂能够通过升高脑组织中SOD的含量，同时降低MDA的含量来达到抗氧自由基氧化损伤的作用，从而对缺血再灌注脑组织产生一定的保护作用。

［1］冯加纯.细胞内钙超载和自由基与迟发性神经元坏死［J］.中风与神经疾病杂志，1993，10（3）：188-189.

［2］Koizumi J，Yoshida Y，Nakazawa T，et al.Experimental studies of ischemic brain edema：A new experiment model of cerebralem bolism in rats in which recirculation can be introduced in the ischemic area［J］.Stroke，1986，8（1）：1-8.

［3］Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without Craniectomy in rats［J］.Stroke，1989，20（1）：84-91.

［4］郭建队，杨秀清，陈梅.气虚血瘀证脑梗死动物模型的制作［J］.现代中医药，2005，25（3）：1-3.

［5］Suzuki J.Chemiluminescence in hypoxic brain［J］.Stroke，1988，19：65.

［6］Kinute Y，Kikuchi H，Ishikawa M，et al.Lipid peroxidation in focal cerebral ischemial［J］.Neurosurg，1989，7（3）：420.