瘤胃纤维降解菌株的筛选

朱继红，孙满吉，张永根

（东北农业大学动物科学技术学院，哈尔滨 150030）

瘤胃作为一个庞大的微生物资源库，存在着大量的细菌、真菌及原虫，还有少量的噬菌体。经过长期的适应和选择，微生物和宿主之间、微生物与微生物之间处于一种相互依赖、相互制约的动态平衡系统中。瘤胃中50%的纤维素消化，宏观认为是瘤胃细菌、真菌和原虫共同作用的结果，而在这一消化过程中，80%由细菌完成，主要是由于细菌数量及代谢产物多样性的绝对优势[1-2]。外国对瘤胃细菌及真菌的分离已经取得较多成果，目前已经分离出200多个微生物种类[3]。我国关于瘤胃微生物分离的研究较少，目前报道的仅有张晓华从瘤胃内容物中分离得到1株瘤胃梭菌，彭海宏分离得到1株真菌，刘玉承在瘤胃内容物中分离出7株滤纸降解能力显著的细菌，王平筛选出1株产纤维素酶活较高的米曲霉菌[3-6]。瘤胃微生物的研究已成为反刍动物研究的重点之一，本试验以稻草秸秆为唯一碳源，选择对稻草秸秆利用效果较好的菌株，通过测定菌株的纤维素酶活及对稻草秸秆的降解率，拟筛选一株瘤胃纤维降解菌。

1 试验材料

1.1 瘤胃液的采集

选用装有永久性瘘管的健康瘘管牛，自由饮水，在正常采食后，使用自制负压取样器于瘤胃内不同部位采集瘤胃液，过滤，通入CO2，于37℃保存迅速送回实验室，备用。

1.2 稻草秸秆

稻草秸秆为收获水稻后的优质，无霉变的稻草秸秆，烘干后粉碎（40～60目），备用。

1.3 培养基

选择性初筛固体培养基：KH2PO41.00 g、Mg⁃SO40.3 g、NaCl 0.1 g、NaNO32.5 g、CaCl2·6H2O 0.1 g、FeCl30.01 g、稻草粉20 g、pH自然；CMC-Na分离培养基：CMC-Na 20 g、Na2HPO42.5 g、KH2PO41.5 g、蛋白胨2.5 g、琼脂20 g、pH 7.0～7.5；纤维素-刚果红鉴别培养基[7]：（NH4）2SO42.0 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、 K2HPO4l.0 g、 NaCl 0.5 g、 CMC-Na 2.0 g、刚果红0.4 g、琼脂20 g、pH 7.0；种子培养基（PDA）：可溶性淀粉6 g，葡萄糖20 g，酵母粉2 g，蛋白胨 5 g，KH2PO42 g，MgSO40.3 g，琼脂20 g，蒸馏水1000 mL；固体发酵培养基：稻草秸秆粉、玉米粉、豆粕粉、麸皮按比例混匀，固液比为1∶1.5。

1.4 主要仪器设备

生物净化工作台DL-CJ-ZND型，由北京东联哈尔滨仪器制造有限公司生产；全温度恒温度气浴摇床HZQ-C型，由哈尔滨市东联电子技术开发有限公司生产；立式压力蒸汽灭菌锅YXQ-LS-30SI型，由南京莱布公司生产。

2 试验方法

2.1 菌株初筛

在无菌状态下取瘤胃液用生理盐水进行不同梯度的稀释。选取其中的3个稀释梯度各0.1 mL，涂布于选择性初筛平板培养基上，每个稀释度3个重复，置于37℃CO2恒温培养箱，连续培养24～48 h后，进行观察分离。

2.2 菌株纯化

用无菌接种环挑取单个菌落，用无菌生理盐水稀释，接种于CMC-Na分离培养基上，进行单菌落培养，反复多次，直至平皿中菌落形态完全一致，镜检后，置于4℃冰箱保存。

2.3 菌株鉴别

将纯化菌株用生理盐水稀释接种于刚果红鉴别培养基上，置于37℃CO2恒温培养箱，连续培养72 h，用1 moL·L-1NaCl溶液脱色20 min，在菌落周围有透明圈产生证明该菌种产纤维素酶。用游标卡尺分别测量透明圈直径和菌落直径，根据透明圈直径/相应菌落直径初步确定产纤维素酶较高的菌株。

2.4 固体发酵复筛

将混匀的固体发酵培养基定量地装入500 mL的三角瓶中，高压灭菌后冷却，将种子培养基上生长良好的菌落用无菌生理盐水冲洗制成孢子悬浮液，按10%的比例接种，混匀，置于37℃恒温箱内培养5 d，取样测酶活。对照组加入10%的无菌生理盐水。

2.5 纤维素酶活的测定

纤维素酶活的测定参照Bowman等方法[8]。本试验酶活性的测定方法为DNS法。

2.5.1 粗酶夜的制备

取固体发酵物4.0 g，加入生理盐水46 mL浸泡2 h后，13000 rpm离心5 min，取上清液作为粗酶液。

2.5.2 葡萄糖标准曲线的制作

准确称取于105℃烘干的无水葡萄糖1.00 g，配成浓度为1mg·mL-1的葡萄糖溶液，再分别配成浓度为0、 0.1、 0.2、 0.3、 0.4、 0.5、 0.6、 0.7、0.8、0.9、1.0mg·mL-1的标准溶液，吸取葡萄糖溶液1.0 mL于15 mL刻度试管中，然后加入DNS 2.0 mL溶液，混匀，用保鲜膜封口后，煮沸5 min，流水冷却5 min，用蒸馏水定容至10 mL，混匀后在紫外分光光度计上于530 nm处比色，绘制葡萄糖标准曲线，见附图。

附图 葡萄糖标准曲线

2.5.3 羧甲基纤维素酶活性的测定

取15 mL的刻度试管4支，每支试管中加入1.0%羧甲基纤维素钠1 mL，加入0.05 mol·L-1、pH 6.0磷酸盐缓冲液1 mL。1号试管为酶样空白，2、3、4号试管为酶样平行样。50℃水浴震荡30 min，1号管加入磷酸盐缓冲液0.5 mL，2、3、4号试管各加入酶液0.5 mL，50℃下水浴震荡培养60 min（精确）。培养后4支试管立即加入DNS溶液2 mL，保鲜膜封口，涡旋混匀后在开水浴中煮沸5 min，取出后用循环水冷却5 min，用蒸馏水定容至10 mL。以1号管为空白，在紫外分光光度计上于530 nm波长处进行比色。

2.6 数据处理

试验数据采用SPSS 17.0的ANOVA进行统计分析，结果以“平均值±标准误”表示。

3 结果与分析

3.1 初筛结果

经以稻草秸秆为唯一碳源的选择性培养基初筛、分离得到19株菌，分别编号为R1～R19。经纤维素刚果红鉴别培养基培养，观察不同菌株在培养基上的透明圈直径/菌株直径大小，筛选出7株产酶活性较好的菌株，瘤胃纤维降解菌初筛结果见表1。

表1 瘤胃纤维降解菌初筛结果

由表1可知，编号为R5、R3菌株产酶所形成的水解圈直径（R）与菌落直径（r）的比值较大，分别为6.64、6.27，表明该菌具有较高的产酶能力并且酶活力较强，并且具有较强的繁殖能力和分解羧甲基纤维素的能力。

3.2 复筛结果

将初筛出的7株菌用于固体发酵进行复筛。在发酵5 d后，取发酵秸秆制备粗酶液测其羧甲基纤维素酶活和DM消失率，测定结果见表2。

由表2可知，无论是酶活大小还是DM消失率，R3均优于其他6株菌。

表2 瘤胃纤维降解菌液体发酵结果

4 讨论

4.1 纤维素降解菌的初筛

在平板降解圈分离纤维降解菌的诸多方法中，有的受底物来源的限制，有的灵敏度低，需培养较长时间，有的则因杀死菌体而需用影印移植，对分离工作造成诸多不便。而刚果红法则无上述缺点，且对菌体无任何不良影响、灵敏度高、产生的透明圈清晰、易辨认。基于以上特点，刚果红法成为分离纤维降解菌最直观、最快捷的方法。有研究者认为，对数酶浓度同刚果红染色水解圈存在线性关系，产酶越多，透明圈越大，产酶越快，透明圈出现越早。此法除可用于识别产纤维素酶的菌株，还可用于初步判定酶活性高低。本试验通过纤维素酶法筛选出可产纤维素酶的菌株19株，确定透明斑直径/菌落直径较大的7株菌作为复筛对象。然而，有研究认为，透明圈的大小可以直接反映产酶浓度的高低，但不能完全代表菌株产酶能力。其原因主要为固体和液体培养基条件的不同；不同菌株的生长及产酶速度均不同；菌落大小及在平板上堆积情况的不同等都会造成透明圈大小不同，所以固体发酵复选必不可少。

4.2 纤维素酶活力的测定

纤维降解菌的性能大多用羧甲基纤维素酶来衡量。蔡燕飞等从自然界中筛选分离获得具有高效分解纤维素功能的克雷伯氏菌、假单胞菌和嗜麦芽窄食单胞菌，假单胞菌属不仅能分解纤维素，而且对二氯酚、阿特拉津等有机废弃物有降解功效，克雷伯氏菌属有固氮和分解纤维素功能，嗜麦芽窄食单胞菌对植物发现各单一菌株对纤维素类物质均有一定的降解效果，其羧甲基纤维素CMC酶相对活性为0.93 cm·d-1[9]。本试验通过液体发酵试验，测定发酵后液体的纤维素酶活及滤渣的DM消失率，发现待选的7株菌中，纤维素酶活度最高能达到5.94 U·g-1，相应的DM消失率达到23.73%。中科院微生物菌种保藏中心的产纤维素酶专用菌株绿色木霉（trichodermasp）AS3·3711，在优化的培养基上发酵，最高为7.0 U·g-1[10]。故可推测对菌株液体发酵培养基进行优化，本试验分离的7株菌的酶活力还能有所提高。

5 结论

分离得到19株对纤维降解有作用的菌株，其中有7株降解作用显著，分别为R2、R3、R4、R5、R7、R14、R19，综合刚果红染色、纤维素酶测定及DM消失率测定，最终以R3效果最佳，其透明斑直径/菌落直径为6.27、纤维素酶活为5.94 U·g-1、DM消失率达到23.73%。

[1]Doerner K C,White B A.Assessment of the endo-1,4-beta-glu⁃canase components of ruminococcus flavefaciens FD-1[J].Ap⁃plied Environ Microbiology,1990,56（6）:1844-1850.

[2]Gerwig G J,De W P,Kamerling J P,et al.Novel O-linked car⁃bohydrate chains in the cellulase complex(cellulosome)of Clos⁃tridium thermocellum.3-O-Methyl-N-acetylglucosamine as a constituent of a glycoprotein[J].J Biol Chem,1989,264（2）:1027-1035.

[3]刘玉承.32株瘤胃纤维降解细菌的分离鉴定与保藏研究[D].呼和浩特:内蒙古农业大学,2007.

[4]张晓华,谭蓓英,刘敏雄.一个分解纤维素的瘤胃梭菌新种[J].微生物学报,1995,35（6）:397-399.

[5]彭海宏,木合塔尔,古丽格那,等.厌氧真菌在山羊瘤胃中的分离[J].草食家畜,1999（2）:24-25.

[6]王平.牛瘤胃中纤维降解菌的分离鉴定及对玉米秸秆发酵效果的研究[D].郑州:河南农业大学,2010.

[7]郭成栓,欧阳蒲月,崔堂兵,等.一株碱性纤维素酶产生菌的分离、鉴定及酶谱分析[J].生物技术,2011,21（1）:57-59.

[8]Bowman J G,Firkins J L.Effects of forage species and particle size on bacterial cellulolytic activity and colonization in situ[J].Jour⁃nal of Animal Science,1993,71（6）:1623-1633.

[9]蔡燕飞,李华兴,彭桂香,等.纤维素分解菌的筛选及鉴定[J].林产化学与工业,2005,25（2）:67-70.

[10]晓芳,徐旭士,吴敏,等.一株纤维素分解菌的分离与筛选[J].生物技术,2001,11（2）:28-30.