药物递呈载体对提高CpG-DNA免疫刺激活性的作用

范 媛，谢光武，黎晓敏

（1.重庆市万州动物卫生监督所，重庆 404000；2.西南大学动物科技学院，重庆 400715）

免疫佐剂CpG-DNA的发现源于早期人们对癌症治疗的探究。研究已证实，CpG-DNA作为多种抗原的佐剂，表现出独特的免疫增强作用，其可以刺激机体对免疫原产生较早、较强、较持久的免疫应答。此外，CpG-DNA经鼻腔、口腔、直肠等途径免疫接种后，具有明显的黏膜佐剂的效应；而作为新型疫苗的佐剂，其能够克服新型疫苗中PAMP不足的缺陷，通过模拟感染过程诱导强烈的免疫应答[1]。然而，CpG-DNA的体内清除和有效递呈却在很大程度上限制了其免疫学应用。特别是APCs细胞对CpG-DNA的结合与摄取是诱发免疫应答的首要环节，而由于受到CpG-DNA半衰期较短和体内核酸酶降解的限制，往往使CpG-DNA在以一定免疫途径进入机体后，很快便被核酸酶降解吸收进入循环系统，细胞的有效摄取率根本无法达到阈值水平，从而降低了CpG-DNA免疫刺激活性。因此，药物载体递呈技术的应用，不仅能够解决体内降解的问题，而且还能有效提高CpG-DNA的免疫刺激活性。这对于有效增强机体的免疫效应、降低刺激性、较快产生抗体以及刺激细胞免疫具有重要意义。

1 纳米载体

递呈载体纳米化处理使得纳米粒具有无免疫原性、细胞毒性；有较高的基因转染效率，可获得靶基因的长期稳定表达；可保护药物或靶基因不受机体血浆或组织细胞中多种酶类和补体的破坏。武梅等对纳米粒径的PLG和脂质体作为包装分子包裹含CpG序列的pUC18质粒对猪副伤寒疫苗的免疫增效进行了比较，结果显示，其免疫增强效果同脂质体包裹后的免疫佐剂效应相似或更强[2]。向一等采用壳聚糖纳米粒包裹CpG-DNA联合重组乙肝疫苗具有增强免疫抑制小鼠的免疫应答能力[3]。彭蓉等也成功地采用壳聚糖纳米颗粒（CNP）包裹CpG ODN，并发现CpG-DNA具有高效诱导小鼠对乙肝疫苗的体液免疫应答和细胞免疫应答，减少佐剂用量[4]。Joseph等以纳米粒脂质体包裹CpG-DNA，也可以诱导机体较强的免疫应答反应，且共度试验中能够产生有效的免疫保护力[5]。由于纳米载体包裹，CpG-DNA在机体内可以诱导高水平的SIgA表达，可以作为很好的黏膜免疫佐剂[6-7]。这些都提示纳米载体的应用有利于CpG-DNA的有效递呈，从而全面增强机体的免疫应答。

2 脂质体和脂质体复合物

脂质体作为递呈载体是临床应用较早且发展最为成熟的一类新型靶向制剂，具有无毒、无免疫原性、可生物降解等特点。脂质体及其脂质体复合物作为DNA载体，可以有效提高免疫佐剂CpGDNA的生物活性，增强APCs的吞噬效应，提高其抗原提呈效率和能力；延长体内停留时间，形成仓库效应；减少佐剂、疫苗使用量、降低毒副作用等[8-9]。Jaafari等采用水合脱水法将CpG-DNA和利什曼原虫抗原（rgp63）包裹于脂质体中，并免疫BALB/c小鼠，攻毒试验表明，脂质体包裹组能够产生很好的免疫保护力，提高IgG2a/IgG1和诱导产生高水平的IFN-g[10]。Wilson等人用脂质体纳米包裹CpG ODN后不同途径免疫ICR小鼠后观察其免疫增效作用，结果发现，脂质体不仅能够显著提高APCs对CpG-DNA的吞噬，节约佐剂用量，提高机体的体液免疫和细胞免疫；同时，其药代动力学研究结果表明，包裹后的CpG-DNA的转运和分布具有很高的靶向性，且与免疫的途径具有一定的相关性[11]。孙瑞林等在探讨多聚胺胆固醇阳离子脂质体（PCL）与CpG-DNA复合物对哮喘小鼠肺组织嗜酸性粒细胞（EOS）的影响中发现，PCL雾化介导可以减轻以EOS为特征的炎症反应，利用PCL为转染载体包裹CpG-DNA，可提高转染效率[12]。

3 藻酸盐微粒

藻酸盐是一种生物可降解材料，在特定条件或自然条件下能够被化学试剂、微生物或酶降解的材料，其具有良好的生物相容性，且降解产物对机体不产生毒副作用。当其作为免疫佐剂CpG-DNA的载体运送入机体，可有效避免核酸酶降解，促进抗原和佐剂的共递呈，并且通过聚合物的降解缓慢释放包裹的抗原，减少给药次数，获得长期的免疫效果，更能有效地经胞吞作用进入到鼻相关淋巴组织（MALT），诱导机体的黏膜免疫应答，可以成为很好的黏膜疫苗制剂。Ferreiro等利用藻酸盐和多聚赖氨酸制成的嵌段聚合物作为CpG-DNA的载体，可以保护CpG-DNA在机体内不被降解，提高CpG-DNA的稳定性，从而保证其免疫刺激活性的正常发挥[13]。Tafaghodi等利用藻酸盐包封破伤风内毒素（TT）和CpG-DNA两种物质通过鼻免疫患白化病的兔子进行了研究，结果发现，包封后组血清中IgG水平显著高于其他组别且人体试验结果表明，包封能够避免红细胞溶血和鼻刺激黏液物的产生[14]。有报道指出，利用藻酸盐-壳聚糖载体系统包裹CpG-DNA和肝炎细胞B表面抗原免疫机体后，免疫协同CpG-DNA的免疫刺激活性，诱导高水平IFN-g和偏Th1型的抗原特异性免疫应答反应；同时，缓控释抗原-佐剂复合物的释放和递呈[15]。

4 阳离子高聚物

阳离子高聚物通过电荷相互作用与带负电的CpG-DNA分子形成聚电解质复合体，复合物通过内吞作用进入靶细胞，然后发挥免疫调节作用。这些阳离子高聚物内的氨基在生理pH下会发生质子化。质子化的氨基可以中和CpG-DNA质粒表面的负电荷，使DNA分子压缩为体积相对较小的粒子结构，从而使DNA免受核酸酶的降解。阳离子高分子载体种类很多，以壳聚糖为代表的天然阳离子是一种非常具有应用潜力的非病毒类基因载体，有良好的生物相容性和可降解性，其结构中的游离氨基在酸性条件下可结合氢离子形成带正电的多聚物，可与带负电的DNA分子形成复合物，在体内保护DNA免受核酸酶降解，充分利用CpG-DNA的免疫活性，增强免疫应答效应。吕学斌等制备了聚乙交酯丙交酯（PLG）纳米颗粒，比较了阳离子PLG纳米颗粒和脂质体作为载体包裹CpG分子对小鼠体液和细胞免疫反应的影响，结果发现，阳离子PLG纳米颗粒包裹后显著提高免疫小鼠总IgG，小鼠免疫细胞数量明显增加，淋巴细胞增殖活性及IL-2的诱生活性增强；同阳离子脂质体的效应相似或较强，能显著提高裸CpG质粒的免疫增强活性[16]。陈晓琦等采用含编码呼吸道合胞病毒（RSV）抗原质粒DNA的脱乙酰壳多糖DNA纳球，试验证明其能够有效预防急性RSV的感染[17]。Xie等采用聚乳酸-羟基乙酸（PLGA）载体吸附CpG-DNA联合铝制炭疽苗免疫机体后发现，与CpG-DNA和疫苗混合组、疫苗组相比，加入PLGA免疫组的免疫应答水平显著高于其他两组，且具有很好免疫保护作用[18]。祁智等应用壳聚糖（CS）包载 CpG-DNA，制备 CS-CpG-DNA基因载体，不仅提高了CpG-DNA对裂解酶的稳定性；同时，由于壳聚糖的天然免疫活性，协同增强了CpG-DNA的免疫作用能力，产生了更强更持久的免疫应答[19]。另外，溴化十六烷基三甲基胺（CTAB）、溴化十六烷基二甲基乙基铵（CDAB）、双十二烷基二甲基溴化铵（DDAB）、多聚-L-赖氨酸（PLL）、聚乙烯亚胺（PEI）等化学合成试剂也是很好的阳离子递呈载体材料。其作为CpG-DNA和抗原的递呈载体，同样能够有效提高CpG-DNA的佐剂效应，同时兼具靶向、缓释、长效的作用特点。

5 小结

理想的载体应具备靶向特异性，并且可被免疫系统识别；药物释放可控缓释性，能在导入部位形成“抗原贮存库”效应；高度稳定，容易制备，可浓缩和纯化；无毒性，对病人及环境安全无害；具有免疫协同效应。目前，我国关于免疫佐剂CpG-DNA递呈载体的研究还处于起步阶段，尚存在许多空白和需完善的地方。此外，CpGDNA的安全问题仍然是一个不能忽视的问题。所以，今后应着眼于载体、佐剂、抗原三者之间的配比，最适宜的免疫途径以及载体材料的选择对免疫刺激的影响等多方向研究。力求从药动学、药效学、免疫学等理论的多角度进行多分析。相信随着CpG-DNA作用机制的不断清晰，CpGDNA递呈载体的研究不断完善和发展，开发出更适合CpG-DNA临床应用的载体系统，使其在消灭和控制传染病、寄生虫病以及自身免疫性疾病中便能发挥极为重要的作用，显示出极强的使用价值和广阔的应用前景。

[1]McCluskie M J,Weeratna R D,Krieg A M,et al.CpG DNA is an effective oral adjuvant to protein antigens in mice[J].Vaccine,2000,19（7-8）:950-957.

[2]武梅,高荣,李江凌,等.纳米颗粒包裹CpG序列对猪副伤寒疫苗接种小鼠免疫应答的影响[J].生物医学工程学杂志,2005,22（5）:975-979.

[3]向一,祁智,郭敏,等.CpG ODN纳米粒增强免疫抑制小鼠对重组乙肝疫苗的免疫应答[J].中国药师,2007,10（3）:203-206.

[4]彭蓉,黄杰,吴凯源,等.CpG壳聚糖纳米颗粒对小鼠乙型肝炎疫苗免疫应答的影响[J].四川动物,2008,27（4）:538-543.

[5]Joseph A,Louria-Hayon I,Plis-Finarov A,et al.Liposomal im⁃munostimulatory DNA sequence（ISS-ODN）:an efficient paren⁃teral and mucosal adjuvant for influenza and hepatitis B vaccines[J].Vaccine,2002,20（27-28）:3342-3354.

[6]Alcon V,Baca E M,Vega L M,et al.Mucosal delivery of bacteri⁃al antigens and CpG oligonucleotides formulated in biphasic lipid vesicles in pigs[J].Aaps J,2005（7）:566-571.

[7]Mitchell L A,Joseph A,Kedar E,et al.Mucosal immunization against hepatitis A:antibody responses are enhanced by co-ad⁃ministration of synthetic oligodeoxynucleotides and a novel cation⁃ic lipid[J].Vaccine,2006（24）:5300-5310.

[8]Wai M L,Marcel B B,Marie-Paule S R.Enhanced immune re⁃sponse to T-independent antigen by using CpG oligodexynucleo⁃tides encapsulated in liposomes[J].Vaccine,2003,20（1-2）:148-157.

[9]Tafaghodi M,Jaafari M R,Sajadi T S A.Nasal immunization stud⁃ies using liposomes loaded with tetanus toxoid and CpG-ODN[J].European Journal of Pharmaceutics and Biophermaceutics,2006,64:138-145.

[10]Jaafari M R,Badiee A,Khamesipour A,et al.The role of CpG ODN in enhancement of immune response and protection in BALB/c mice immunized with recombinant major surface glyco⁃protein ofLeishmania（rgp63）encapsulated in cationic liposome[J].Vaccine,2007,25（32）:6107-6117.

[11]Wilson K D,Raney S G,Sekirov L,et al.Effects of intravenous and subcutaneous administration on the pharmacokinetics,biodis⁃tribution,cellular uptake and immunostimulatory activity of CpG ODN encapsulated in liposomal nanoparticles[J].International Im⁃munopharmacology,2007,7（18）:1064-1075.

[12]孙瑞林,金发光,巩丽,等.多聚胺胆固醇阳离子脂质体介导CpG ODN雾化吸入对哮喘小鼠肺组织嗜酸性粒细胞的影响[J].解放军医学杂志,2008,33（5）:552-554.

[13]Ferreiro M G,Tillman L G,Hardee G,et al,Alginate/poly-L-ly⁃sine microparticles for the intestinal delivery of antisense oligonu⁃cleotides[J].Pharmaceutical Research,2002,19（6）:755-764.

[14]Tafaghodi M,Tabassi S A S,Jaafari M R.Induction of systemic and mucosal immune responses by intranasal administration of al⁃ginate microspheres encapsulated with tetanus toxoid and CpG-ODN[J].International Journal of Pharmaceutics,2006,319（1-2）:37-43.

[15]Borges O,Cordeire dasilva A,Tavares J,et al.Immune response by nasal delivery of hepatitis B surface antigen and co-delivery of a CpG ODN in alginate coated chitosan nanoparticles[J].Europe⁃an Journal of Pharmaceutics and Biopharmacentics,2008,69（2）:405-416.

[16]吕学斌,李江凌,高荣,等.阳离子PLG纳米颗粒包裹对CpG序列免疫佐剂效应影响的研究[J].高技术通讯,2003,13（4）:62-66.

[17]陈晓琦,徐葛林.粘膜基因表达疫苗——新的呼吸道合胞病毒疫苗策略[J].国际生物制品学杂志,2004,27（2）:62-64.

[18]Xie H,Gursel I,Ivins B E,et al.CpG oligodeoxynucleotides ad⁃sorbed onto polylactide-co-glycolide microparticles improve the immunogenicity and protective activity of the licensed anthrax vaccine[J].Infection and Immunity,2005,73（2）:828-833.

[19]祁智,李小爱,郭敏,等.壳聚糖基因载体增强CpG-ODN免疫活性研究[J].医药导报,2007,26（4）:356-359.