基于CdSe/ZnS核壳型量子点的高灵敏、快速细菌计数新方法的研究*

傅 昕，张 何，胡家义，石 敏

(湖南工程学院化学化工学院，湖南湘潭411104)

细菌是单细胞微生物的主要类群之一，是所有生物中数量最多的一类。其中一些细菌属于病原体，能引起感染性疾病，比如霍乱、梅毒、炭疽病、尿道炎、膀胱炎和痢疾等。细菌(尤其是病原菌)的检测涉及到食品安全检验、疾病诊断以及环境监测等领域，与人类健康和社会安定息息相关。传统的细菌检测方法(如比浊法和平板计数方法)灵敏度低、费时耗力，不能满足当前食品安全快速检测的要求。近年来，报道了一些的细菌计数的新方法，包括酶联免疫法 (ELISA)[1]、PCR 法[2]和流式细胞计数法[3]，这些新方法虽然缩短了检测时间、增强了检测信号，但是检测仪器昂贵、并且检测前需预先富集[4]。目前，荧光检测方法有效地克服了这些缺点，更有利于快速、简单、有效的对原始样品直接进行细菌计数[5－8]。然而，现有的荧光检测法一般以有机荧光染料作为荧光标记物，因此还是存在许多不足之处。

与传统有机荧光染料相比，量子点具有激发光谱宽、发射光谱对称、半峰宽窄(20 nm～30 nm)，发射波长可调(400 nm到2 μm不等)等特点。另外量子点为多电子体系，荧光效率高于单个分子，且光化学稳定性强，不易分解，不易漂白，在某些情况下其发光时间可达染料分子的100倍。早在1998年Alivisatos[9]等及Nie等[10]首次报道将QDs应用于细胞荧光标记、成像等方面的研究，随着对QDs研究的不断深入，其应用范围由最初的生物学扩展到医药学、食品、环境保护等多个领域[11－14]。裸量子点颗粒(如 CdSe)易受杂质和晶格缺陷的影响，其量子产率很低，化学家们经过多年努力，通过在核表面覆盖另一层晶体结构相似、带隙更大的半导体材料(如ZnS)，使量子点表面无辐射重组位置被钝化、减少激发缺陷，且能有效限制对核的激发，消除非辐射弛豫，使荧光量子产率和光热稳定性都得到了大大的提高[15－18]。因此，核壳型量子点是一种更理想的荧光标记物。目前为止，虽然已经有一些用量子点标记抗原和酶来快速、特异性的检测病原体细菌的报道，但是用核壳型量子点来进行细菌计数的研究还非常少。

本文以乙酰丙酮镉和硬脂酸锌作为前驱体合成了单分散性的、荧光效率高的核壳型量子点，并充分利用核壳型量子点优良的光学性能，以EDC/NHS作为交联剂，金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus(S.aureus)作为检测目标，建立了一种高灵敏的、简单快速的细菌计数新方法。在优化的实验条件下，体系的相对荧光强度随细菌数量的增加而增大，线性范围为102CFU/mL～106CFU/mL(跨越4个数量级)，检测限为102CFU/mL。此外，该方法操作简单，不需要昂贵的试剂和仪器，检测时间短(1 h～2 h)。我们还对5种实际样品进行了细菌数量测定，检测结果与传统的平板计数方法基本一致，相对标准偏差在3.6% ～8.1%之间。由此可见，基于CdSe/ZnS核壳量子点的荧光标记技术，为细菌的快速、灵敏的定量检测提供了新的契机，显示出广阔的应用前景。

1 实验部分

1.1 仪器

F－2500型荧光分光光度计(日本日立公司);JEOL JEM－1230型透射电镜TEM(Transmission E-lectron Microscopy;日本电子株式会社);PHS－25型酸度计(上海虹益仪器仪表有限公司);SHZ－82水浴恒温振荡器(金坛市文华科教实验仪器厂);Zeiss荧光倒置显微镜(Zeiss Axio Observer Z1);QYC－200全温培养摇床(上海福玛公司);TD4A型台式离心机(长沙英泰仪器有限公司)。

1.2 试剂

三辛基氧化膦(TOPO，90%)，三辛基膦(TOP，98%)，十六烷基胺(HDA，90%)，1，2－十六烷二醇(90%)，乙酰丙酮镉(＞99.9%)，硬脂酸锌(95%)，3－巯基丙酸(MPA，＞99.0%)，1－乙基－(3－二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC，＞98%)，N－羟基琥珀酰亚胺(NHS，＞98%)，Se粉(＞99.5%)，硫粉(99.5%)均购买于 Sigma-Aldrich Chemical Co。

1.3 实验方法

1.3.1 巯基丙酸修饰的CdSe/ZnS核壳型量子点的合成

CdSe核的制备 参照并改进文献[19]方法，在N2保护下，将11.84 mg硒粉溶入2.5 mL TOP 中，得到Se的前驱体溶液(TOPSe);将0.310 6 g乙酰丙酮镉和0.568 g 1，2－十六烷二醇溶解于3 mL TOP中，制得Cd前驱体溶液;然后往三颈烧瓶中依次加入3.125 g TOPO、2.875 g HDA 以及 1.7 mL TOP，缓慢加热到360℃，将Cd、Se前驱体溶液快速加入，并调节温度至300℃，直到获得所需波长的量子点。

CdSe/ZnS核壳量子点的制备[20]氮气保护下，0.316 g硬脂酸锌溶于2.5 mL甲苯中，得 Zn前驱体溶液;16 mg的S粉溶于2.5 mL TOP中，得S前驱体溶液;向三颈烧瓶中加入20 mg CdSe、4 mL正庚烷、2.5 g TOPO和1.5 g HDA。混合溶液加热至190℃，然后把Zn、S的前驱体溶液缓慢加入反应器中，保持温度在190℃ ～200℃反应1 h，即得CdSe/ZnS核壳量子点。

最后将20 mg CdSe/ZnS核壳型量子点溶于1.0 mL 氯仿中，加入 100 μL 0.1 mol/L 的巯基丙酸，搅拌过夜。洗涤干燥后即得水溶性的巯基丙酸修饰的CdSe/ZnS核壳型量子点(MPA-CdSe/ZnS core/shell QDs)[21]。

1.3.2 细菌培养和计数

金黄色葡萄球菌(S.aureus)菌株是由中南大学生物实验室提供。把金黄色葡萄球菌用LB(Luria Bertani)培养基，在37℃中恒温培养48 h。培养出的细菌数量通过平板计数法可以获得。细菌通过无菌的PBS(pH 7.4)溶液离心洗涤，最后在PBS溶液中保存。

1.3.3 MPA-CdSe/ZnS 与细菌的结合过程

MPA-CdSe/ZnS与金黄色葡萄球菌结合用EDC和NHS作为交联剂。为了测试量子点与细菌结合的最佳条件，我们先将100 μL 1 mg/mL的EDC加入200 μL不同浓度的MPA-CdSe/ZnS量子点中，搅拌15 min。再加入100 μL 0.15 mg/mL 的 NHS，反应20 min。EDC与量子点表面的羧基发生反应，形成有活性的中间体，NHS能在水溶液中稳定此中间体[22－23]。最后与细菌在37 ℃孵育10 min ～70 min。混合溶液通过0.22 μm超滤膜纯化，除去过量的量子点。同时我们将不加EDC/NHS的反应体系做为对照实验。

2 结果与讨论

2.1 CdSe/ZnS量子点的性能表征

2.1.1 CdSe/ZnS QDs荧光光谱图

量子点作为一种半导体纳米晶体，粒径不同时会产生不同颜色的荧光。取适量的产物溶液，用F－2500型荧光分光光度计对其进行荧光发射光谱的测定。图1(a)为不同反应时间(30 s，30 min和2 h)取样所得到的量子点的荧光发射光谱图，从图中可以看出，所制备的量子点峰型窄而对称，半峰宽均在30 nm左右，没有拖尾现象，说明其尺寸分布较窄。根据纳米粒子的尺寸D与其荧光峰 λe之间的关系[24]:。以此计算以上 3个反应时间制得的样品(发射波长分别为520 nm、570 nm、615 nm)的粒径分别为 3.0 nm、3.3 nm、4.9 nm。插图为反应2 h后所得的核壳型量子点的透射电镜图。由图可以看到，量子点大小为5 nm左右，形状呈类球型，并且分布均匀，很少团聚，具有良好的单分散性和均一性。该透射电镜(TEM)表征与粒径计算结果互为佐证。

图1

2.1.2 CdSe/ZnS QDs荧光稳定性考察

我们还将CdSe/ZnS核壳型量子点与异硫氰酸荧光素(FITC)和德克萨斯红(Texas Red)两种荧光染料的抗光漂白性能进行了比较。我们采用F－2500型荧光分光光度计进行荧光强度的测定，连续扫描60 min，并实时观察其荧光强度的变化。结果表明CdSe/ZnS抗光漂白性大大优于荧光染料。FITC和Texas Red的荧光强度在15 min时已经减低了15%，在30 min时已经基本消失，而CdSe/ZnS量子点的荧光强度在60 min时基本维持不变(图1(b))。此外，进一步考察了放置时间对于其稳定性的影响，实验中发现，室温下放置5个月以后，几乎观察不到沉降等现象，光谱性能依然良好，表明该量子点具有非常优良的稳定性，为进一步的应用研究提供了保证。上述性能表征结果表明，所制备的CdSe/ZnS量子点具有良好的光谱性能，并且大小均一，单分散性好，为接下来的应用研究奠定了基础。

2.2 MPA-CdSe/ZnS量子点检测细菌的原理

由于巯基丙酸修饰的量子点表面有许多羧基基团，EDC可以与量子点表面的羧基发生反应，形成有活性的中间体，NHS在水溶液中稳定此中间体，最后中间体与细菌表面蛋白上的氨基结合(图2)。所以细菌的数量越多，与其结合的量子点也越多，体系荧光强度也就越大，从而可以根据荧光强度的变化达到定量检测细菌的目的。

图2 CdSe/ZnS量子点检测细菌的原理

2.3 实验条件的优化

2.3.1 量子点和细菌孵育时间的选择

为了确定最佳的孵育时间，我们做了一系列条件实验。首先，将100 μL 1 mg/mL 的 EDC、200 μL 5.0 mg/mL MPA-CdSe/ZnS 量子点和100 μL 0.15 mg/mL的NHS反应20 min。然后加入一定数量的细菌，在37℃中分别孵育10 min～70 min。图3(a)显示了孵育时间对体系荧光强度的影响。从图中看出，体系的荧光强度在0～50 min内随时间的增长而升高，超过50 min后荧光强度基本保持稳定，说明50 min时反应已经基本完成。故本实验选择孵育时间为50 min。

图3 体系荧光强度所受影响

2.3.2 MPA-CdSe/ZnS QDs稀释度的选择

我们还考察了量子点稀释度对于体系荧光强度的影响(图3(b))，量子点的原始浓度为5.0 mg/mL。结果表明，量子点在1∶2～1∶32稀释度范围内时，体系的荧光强度随着量子点的稀释度的减小(即量子点浓度的增大)而增大，在稀释度为1∶2时，荧光强度达到最大值。因此，在以下试验中，选用1∶2的量子点稀释度，即量子点浓度为2.5 mg/mL。

2.4 MPA-CdSe/ZnS与细菌结合后的荧光显微镜成像

为了验证量子点与细菌完全结合，我们借助荧光显微镜成功的进行成像探测研究(图4)。由图可知，量子点EDC/NHS的交联作用下，已经成功的与S.aureus结合，细菌表面表现出较强的荧光(图4(b))，进一步证实了实验的原理。同样，作为平行对照实验，对于没有EDC/NHS交联剂的体系我们也进行了荧光显微镜成像(图4(c))，细菌表面观察不到荧光信号的表达。由此我们可以得出，该方法制备的核壳型量子点荧光纳米颗粒具有良好的特异性，为接下来的定量检测奠定了坚实的基础。

图4 EDC/NHS存在下，量子点与S.aureus结合后的明视场成像(A)和荧光成像(B);(C)无EDC/NHS时，量子点与S.aureus结合后的荧光成像

2.5 检测范围和检测限的考察

我们进一步考察了基于MPA-CdSe/ZnS核壳量子点对细菌定量测定的线性范围和最低检测浓度，在最优检测条件下即在37℃下，S.aureus与2.5 mg/mL CdSe/ZnS QDs反应50 min后进行测定，结果如图5所示。从图5可以看出，金黄色葡萄球菌总数量在102CFU/mL～108CFU/mL范围内时，体系的相对荧光强度随细菌数量的增加而增大。且当金黄色葡萄球菌总数量在102CFU/mL～106CFU/mL范围时，细菌总数与体系荧光强度呈现出良好的线性关系(图5插图)，线性回归方程为 Y=427.586X－677.022，线性相关系数 R为0.99649。由此可以看出，该方法的线性范围宽(跨越4个数量级)，检测限低(102CFU/mL)，优于基于ATP的生物荧光检测方法(检测限为103CFU/mL)和基于有机染料SYBR GreenⅡ的荧光检测方法(检测限为105CFU/mL)。并且该方法重现性好，总反应时间短(从加样到获得最后的信号少于2 h)。综上所述，基于MPA-CdSe/ZnS核壳量子点对细菌定量检测的方法可用于一定数量范围内细菌的定量研究。

图5 S.aureus数量与体系荧光强度的标准曲线图和线性关系图(插图)

2.6 实际样品检测

为了进一步证实该方法的可行性和实用性，我们把该方法用于实际样品的细菌计数中。表1即为5个实际样品的测定结果。所有样品在测试前都需经过离心过滤纯化。从表1可以得出，5个实际样品的测试结果和常用的平板计数法基本一致，相对标准偏差(RSD%)都在3.6～8.1之间，是非常令人满意的，有望进一步实际应用。

表1 实际样品的检测结果

3 结论

本工作合成了具有优良光学性能、分散性好、粒径均一的CdSe/ZnS核壳量子点的CdSe/ZnS核壳型量子点。在EDC/NHS交联作用下，以量子点作为荧光探针，金黄色葡萄球菌(S.aureus)作为目标细菌，利用量子点表面羧基与细菌表面氨基之间的作用，建立了一种高灵敏的、简单快速的细菌计数的新方法。在最优化的实验条件下，体系的相对荧光强度随细菌数量的增加而增大，该方法的线性范围为102CFU/mL～106CFU/mL，检测限为102CFU/mL。该方法有效克服了有机荧光染料光稳定性差等缺陷，具有简单直接、条件温和、检测时间短(1 h～2 h)、灵敏度高和线性范围宽(跨越4个数量级)等优点。此外，我们还对5种实际样品进行了细菌计数，检测结果与平板计数方法基本一致，相对标准偏差在3.6% ～8.1%之间，并且有好的重现性。

[1]Bonwick G，Smith C，Walliams J.Immumoassays for Food Safety and Quality[J].Food Sci Technol，2003，17(1):32－34.

[2]Salinas F，Garrido D，Ganga A，et al.Taqman Real-Time PCR for the Detection and Enumeration of Saccharomyces Cerevisiae in Wine[J].Food Microbiol，2009，26(3):328－332.

[3]Gunasekera S T，Attfield V P，Veal A D.A Flow Cytometry Method for Rapid Detection and Enumeration of Total Bacteria in Milk[J].Appl Environ Microb，2000，66(3):1228－1232.

[4]Johnson J L，Rose B E，Sharar A K，et al.Methods Used for Detection and Recovery of Escherichia Coli O157:H7 Associated with a Food-Borne Disease Outbreak[J].J Food Prot，1995，58(6):597－603.

[5]田青，刘儒平，刘晓红，等.大肠杆菌特异性快速检测系统研制[J].传感技术学报，2010，23(7):899－902.

[6]SU Xiaoli，LI Yanbin.Quantum Dot Biolabeling Coupled with Immunomagnetic Separation for Detection of Escherichia Coli O157:H7[J].Anal Chem，2004，76(16):4806－4810.

[7]Maruyama F，Yamaguchi N，Kenzaka T，et al.Simplified Sample Preparation Using Frame Spotting Method for Direct Counting of Total Bacteria by Fluorescence Microscopy[J].J Microbiol Methods，2004，59(3):427－431.

[8]LUO Jinping，LIU Xiaohong，TIAN Qing，et al.Disposable Bioluminescence-Based Biosensor for Detection of Bacterial Count in Food[J].Anal Biochem，2009，394(1):1－6.

[9]Bruchez M J，Moronne M，Gin P，et al.Semiconductor Nanocrystals as Fluorescent Biological Labels[J].Science，1998，281(5385):2013－2016.

[10]Chan W C W，Nie S.Quantum Dot Bioconjugates for Ultrasensitive Nonisotopic Detection[J].Science，1998，281(5385):2016－2018.

[11]ZHONG Ping，YU Ying，WU Jianzhong，et al.Synthesis of Mercaptoethylamine-Coated CdSe/CdS Nanocrystals and Their Use for DNA Probe[J].Anal Sci，2007，23(9):1085－1089.

[12]XUE Xiuheng，PAN Jian，Xie Huiming，et al.Fluorescence Detection of Total Count of Escherichia Coli and Staphylococcus Aureus on Water-Soluble CdSe Quantum Dots Coupled with Bacteria[J].Talanta，2009，77(5):1808－1813.

[13]ZHANG Yun，DENG Zhengtao，YUE Jiachang，et al.Using Cadmium Telluride Quantum Dots as a Proton Flux Sensor and Applying to Detect H9 Avian Influenza Virus[J].Anal Biochem，2007，364(2):122－127.

[14]ZHU Liang，Ang S，LIU Wen-tso.Quantum Dots as a Novel Immunofluorescent Detection System for Cryptosporidium Parvum and Giardia lamblia[J].Appl Environ Microbiol，2004，70(1):597－598.

[15]王国涛，贾丽萍，赵摇倩，等.CdTe/CdS量子点在Nafion/羟基磷灰石膜上的电化学发光及其应用于肌红蛋白的高灵敏检测[J].传感技术学报，2011，24(9):1242－1247.

[16]Dabbousi B O，Rodriguez-Viejo J，Mikulee F V，et al.(CdSe)ZnS Core-Shell Quantum Dots:Synthesis and Characterization of a Size Series of Highly Luminescent Nanocrystallites[J].J Phys Chem B，1997，101(47):9463－9475.

[17]Matoussi H，Mauro J M，Goldman E R，et al.Self-Assembly of CdSe-ZnS Quantum Dot Bioconjugates Using an Engineered Recombinant Protein[J].J Am Chem Soc，2000，122(49):12142－12150.

[18]Li J J，Wang A，Guo Wenzhuo，et al.Large-Scale Synthesis of Nearly Monodisperse CdSe/CdS Core/Shell Nanocrystals Using Air-Stable Reagents Via Successive Ion Layer Adsorption and Reaction[J].J Am Chem Soc，2003，125(41):12567－12575.

[19]Snee P T，Chan Y，Nocera D G，et al.Whispering-Gallery-Mode Lasing from a Semiconductor Nanocrystal/Microsphere Resonator Composite[J].Adv Mater，2005，17(9):1131－1136.

[20]Reiss P，Bleuse J，Pron A.Highly Luminescent CdSe/ZnSe Core/Shell Nanocrystals of Low Size Dispersion[J].Nano Lett，2002，2(7):781－784.

[21]PENG Xiaogang，Schlamp M C，Kadavanich A V，et al.Epitaxial Growth of Highly Luminescent CdSe/CdS Core/Shell Nanocrystals with Photostability and Electronic Accessibility[J].J Am Chem Soc，1997，119(30):7019－7029.

[22]FU Xin，HUANG Kelong，LIU Suqin.A Robust and Fast Bacteria Counting Method Using CdSe/ZnS Core/Shell Quantum Dots as Labels[J].J.Microbiol.Methods，2009，79(3):367－370.

[23]WANG Hiaoqiao，WANG Jianhao，LI Yongqiang，et al.Multicolor Encoding of Polystyrene Microbeads with CdSe/ZnS Quantum Dots and Its Application in Immunoassay[J].J Colloid Interface Sci，2007，316(2):622－627.

[24]WU Dengguo，MARTIN E K，Van Patten P G.A New Class of Capping Ligands for CdSe Nanocrystal Synthesis[J].Chem Mater，2005，17(25):6436－6441.