不同年龄大鼠心血管组织中钙调神经磷酸酶活性的变化

周立远 吴天清 张旭东 王家珍

（川北医学院附属三台医院 三台县人民医院，四川 三台 621100）

钙调神经磷酸酶（calcineurin，CaN）在Ca+信号通路中扮演一个重要的多功能调节因子[1]。可调节神经介质释放神经突触的生长发育，与学习记忆和老年痴呆有关；在T细活化中起调节枢纽作用；在细胞凋亡中起中心环节作用，尤其是新近研究表明CaN-T细胞活化核因子（NF-AT3）途径广泛存在于心肌、血管平滑肌细胞等，CaN可参与维持心血管结构和功能、抑制血管平滑肌细胞增殖、心肌细胞肥大，在心血管生理及病理生理过程中均发挥重要作用[2]。

CaN具有促进心脏血管生长及产生生理病理变化的作用，但CaN的作用效果跟年龄关系的研究较少。我们对不同年龄大鼠心脏和主动脉平滑肌组织的CaN活性测定，进一步证实它们在心血管中的组织分布差异性，观察它们在机体衰老过程中随年龄变化的趋势，提供关于心血管老化的一些研究根据，并查找相关原因。

1 材料与方法

1.1 实验材料与仪器

1.1.1 主要实验仪器：超低温冰箱（USA）；高速离心机；UV-1100紫外-可见分光光度计；SN-695B型γ放射免疫计数仪；6531型电动搅拌机（匀浆机）；DHG-9070型恒温干燥箱。

1.1.2 主要试剂及配制：钙调神经磷酸酶测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所。该试剂盒有十一种试剂，其中定磷剂现用现配。其他用品都是国产分析纯。

1.1.3 实验动物：选购温州研究所动物实验中心的Wistar大鼠，随机选择1月年龄的大鼠12只、6月年龄的大鼠12只及24月年龄的大鼠12只，雌雄个体不再随机分配，1月年龄的大鼠体质量约为103.7g，6月年龄的大鼠体质量约为230.1g，24月年龄的大鼠体质量约为331.2g。把所购大鼠按年龄分为三组，即分为1月年龄组、6月年龄组和24月年龄组，并在各组内分别随机选择12例健康大鼠，可命名为幼年组、青年组、老年组。

1.2 标本采集

1.2.1 在大鼠腹部注入50mg/kg的戊巴比妥钠进行麻醉，立即剖开胸部，在右心室内取出2mL血液，并将其放入抗凝试管内，与由0.3M EDTA二钠30µL、0.34M 8-羟基喹啉30µL及0.32M二硫基丙醇15µL组成的抑肽酶混合均匀，并在冰水中进行冷却到4℃，1000r/min离心5min，最后把分离出来的血浆放入冰箱内冷藏。

1.2.2 取出心脏血液后，应立即用生理盐水把主动脉和心脏洗净并放入液氮，然后取出剪碎，一半加入4倍体积的组织匀浆液（MOPS 0.1mol/L、pH 7.0、EDTA 2mmol/L、PMSF 75mg/L、trypsin in-hibitor 10mg/L、TPCK 10mg/L、leupeptin 1mg/L），在Polytron匀浆器上匀浆然后低温离心机中（4℃）以14000r/min离心30min，上清即为组织提取液。少量用考马斯亮蓝法测定组织提取液中蛋白含量，其余作酶活性测定。

1.3 检测指标

1.3.1 蛋白含量测定：考马斯亮蓝法测定心脏和主动脉平滑肌中CaN蛋白含量。

1.3.2 取组织匀浆上清液用生理盐水按比例稀释成2%组织匀浆液。

1.3.3 按表1操作。

表1 操作步骤

混匀，静置10min，于595nm处，1cm光径，UV-1100型分光光度计测定OD值。

1.3.4 蛋白含量计算：蛋白含量（g/L）=测定管OD值/标准管OD值×标准管浓度（g/L）。

1.4 CaN活性测定

试剂共11种，检测时现配备1mmol/L标准磷贮备液和定磷剂然后按照说明操作。

CaN活性计算：规定每小时每毫克蛋白的钙调神经磷酸酶分解底物PNPP产生1µmol/L无机磷的量为一个CaN活性单位。

公式：组织中CaN活力（nmol Pi/mg protein/hour）=（测定管OD值-对照管OD值）/（标准管OD值-标准空白管OD值）×标准管磷含量×反应体系中样本稀释倍数×3÷取样量中蛋白毫克数。

1.5 统计学处理

使用SPSS13.0软件，对所得数据进行统计，统计数据用（±s）来表示。各组之间的差异运用单因素方差分析SNK法和t检验法来统计。

2 结 果

不同月龄大鼠心肌及主动脉组织CaN的活性减检测显示：大鼠心肌与主动脉组织CaN活性随月龄增大而降低，三组间相比差异有显著性（P＜0.05），不同月龄大鼠心肌组织CaN活性比同月龄主动脉CaN活性高（P＜0.05）。不同月龄大鼠心血管组织中CaN活性测定结果见表2。

表2 不同月龄大鼠心血管组织中CaN活性测定结果[(±s)，(nmol Pi/mg protein/hour)]

表2 不同月龄大鼠心血管组织中CaN活性测定结果[(±s)，(nmol Pi/mg protein/hour)]

注：大鼠心肌CAN活性与1月龄组比较，◎P＜0.05；与6月龄比较，☆P＜0.05；主动脉CAN活性与1月龄组比较，○P＜0.05；与6月龄比较，◆P＜0.05；1月龄组间主动脉CAN活性与心肌CAN活性比较（★P＜0.05）；6月龄组间主动脉CAN活性与心肌CAN活性比较（▲P＜0.05）；24月龄组间主动脉CAN活性与心肌CAN活性比较（●P＜0.05）

1月龄组(n =12) 6月龄组(n =12) 24月龄组(n =12)心脏CaN活性 2.84±0.61 2.26±0.45◎ 1.58±0.38◎☆主动脉CaN活性 2.10±0.58★ 1.56±0.35○▲ 1.06±0.43●○◆

3 讨 论

迄今为止，CaN为仅有的一类通过Ca2+/钙调素（Calmodulin）在细胞内进行信号传递调节酶类，这种酶是丝氨酸-苏氨酸蛋白磷酸酶在教科书中又被称为蛋白磷酸酶2B，PP2B。CaN具有去磷酸化的效果，其重要的生理作用为通过多条信号传导或利用去磷酸化的作用来调节其他信号传导方式，从而起到调节Ca2+信号和其他第二信使联合作用的效果，协同调节细胞的功能[3]。

心肌肥大可能为内皮素、生长因子、血管紧张素Ⅱ等因素引起的肌肉肥大或心肌细胞对外部刺激的反应而变肥厚，也可能为先天性心脏缺陷所导致，其作用的共同特征都是引起细胞内Ca2+浓度升高。细胞内Ca2+浓度升高或对Ca2+的敏感性增强是心肌肥大发生发展的中心环节，而肥大基因的过度表达是各种病理刺激心肌肥大的共同分子机制。CaN作为唯一的Ca2+/CaM依赖的蛋白磷酸酶，其活性变化势必受到血管平滑肌细胞Ca2+浓度的影响，从而激活终止或肥大信号过度表达[4]。很多研究观察应用CsA处理后，心肌组织及血浆ANP含量分别下降了16%和14%。结果提示，CaN在压力超荷性心肌肥大的信号传递中也可能起到重要作用[5]。

对不同年龄的大鼠脑中CaN含量与活力研究结果反映，CaN在大鼠脑发育时期含量与活力均呈有规律地变化，特别是在大鼠出生后2周左右，CaN含量与活力都显著地升高。胎儿脑组织出生前4周内增长较快；特别是出生后1周左右，CaN比活力达高峰，以后呈缓慢下降趋势；至成人后则基本稳定不再有较大的波动。正常雌性大鼠在性成熟前，生长发育速度很快，子宫平滑肌组织CaN的活性随年龄增长逐渐增加，到性成熟后（16周后）稳定在较高水平。

本实验发现在大鼠的心肌和主动脉平滑肌组织中，心肌里的CaN的活性明显比主动脉平滑肌组织高，这些可能与不同组织功能及发育早晚有关。心肌与血管平滑肌中CaN的活性随着年龄的增长而增高，分析原因可能为心肌细胞内钙离子起着尤其重要的传导作用，起着参与心肌做功及细胞能量代谢的生理功能，若能量代谢发生故障，便会因细胞内清除钙离子能力降低而导致细胞内钙离子的超负荷。钙离子的超负荷会使线粒体受损，从而导致呼吸系统的障碍，引起能量减少，便会导致恶性循环的发生。因此本次调查结果为：钙离子超负荷是引起缺氧后导致心肌细胞不可逆性损伤及细胞凋亡的重要原因[6]。Ca2+超负荷的程度越高，则心肌细胞功能的影响也就越大[7]。CaN在出生后在其含量维持在一定的水平上，对心血管组织发育，功能维持发挥重要作用，但同时随着年龄的增长，心血管系统中受体的下调以及其他相关酶系统活性的降低，CaN的活性也是降低。从实验结果看出在心肌与主动脉该CaN随着年龄的增加其活性是逐渐下降的。CaN活性年龄增加而降低。它们的组织分布差异性与年龄的变化特点，为心血管老化研究提供新的思路。

[1]Klee CB,Cohen P.The calmodulin-regulated protein phosphatase molecular aspects of cellular regulation[M].Amsterdam:Elservier Science,1999:456.

[2]颜伟,卢才义.钙调神经磷酸酶信号通路与心房纤颤相关性研究进展[J].实用医药杂志,2007,24(6):744-745.

[3]Guerini D.Calcineurin,not just a simple protein phosphatase[J].Biochem Bio Phys Res Commun,1997,235(2):271-275.

[4]张荣成,王萌萌,王建春.钙调神经磷酸酶信号通路在心肌肥厚中的作用[J].心血管病学进展,2007,28(2):321-324.

[5]姚泰.生理学[M].5版.北京:人民卫生出版社,2000:45.

[6]邱丽颖,王德宝.不同年龄大鼠平滑肌Ca2+/CaM-PP活性特点[J].张家口医学院学报,1999,16(3):1-2.

[7]刘遂心,孙明,李彤.薯蓣皂甙对缺氧心肌细胞的保护作用研究[J].中国全科医学杂志,2004,7(4):40-41.