缺血再灌注损伤大鼠脑组织细胞因子VEGF mRNA的变化及通心络对其的影响1)
2012-06-09卢昌均鹿俊磊安红伟刘国成周哲屹韦冰心陆兵勋尹瑞雪王立新
卢昌均,鹿俊磊,安红伟,刘国成,周哲屹,韦冰心,陆兵勋,尹瑞雪,王立新
血管内皮生长因子(VEGF)是一种内皮细胞特异的强效有丝分裂原[1]。缺血性脑损伤后,尽早恢复缺血半暗带的血供有助于神经功能的恢复。脑缺血再灌注损伤时,VEGF可通过与其受体结合发挥促进血管内皮细胞的增殖作用,加速新生血管的形成。因此,制作大鼠缺血再灌注损伤(MCAO)模型,采用反转录集合酶链式反应(RT-PCR)检测缺血再灌注损伤后不同时间点神经干细胞增殖分化相关细胞因子VEGF mRNA的变化,并研究通心络胶囊对其表达的影响,探讨通心络胶囊在缺血性脑损伤中的神经保护作用。
1 材料与方法
1.1 栓线制备 采用3-0号尼龙线,线头一端用酒精灯将其烫成球形,在需要长度处折弯作标记,将此线浸泡消毒后,栓线头端浸入0.1%多聚赖氨酸溶液中过夜,60℃烤箱中1h后取出,然后浸入1.25×104U肝素盐水中备用。
1.2 动物模型制作 选用健康雄性SD大鼠180只,体重250 g±20g,南方医科大学实验动物中心提供。随机分为缺血再灌注3d、5d、14d、30d共四批次进行,每批次随机分为通心络剂量组、缺血再灌注模型对照组(等量的生理盐水)和假手术组,每组12只。参考改良的线栓法大鼠缺血性及缺血再灌注模型改进。放入栓线后用消毒钢尺量自颈总动脉分叉处的血管外线长度,计算栓线实际的进入长度。在穿刺点外5mm剪断残留的栓线,埋于胸锁乳突肌下。手术后缝皮,消毒切口,在缺血后90 min拔出线栓形成缺血再灌注动物模型。根据经典的Zea Longa神经功能评分法评分(5级4分法)[2]。除假手术组外,各组选取造模后6h神经功能缺损评分在2分以上的大鼠纳人试验研究,症状轻微(0分及1分)的大鼠剔除。假手术组也插入栓线,但深度为10mm左右,不阻塞大脑中动脉。术后大鼠自由进食、进水,在约20℃的空调环境下单笼饲养。
1.3 给药方法 先将通心络胶囊内容物溶于蒸馏水中配成溶液,通心络组按每只1g/(kg·d)给药,MCAO模型对照组、假手术组用等量蒸馏水分别灌胃,每组大鼠在再灌注清醒后即灌胃给药,每日2次,给药时间分别为3d、5d、14d、30d。
1.4 脑组织制备 将每组大鼠于末次腹腔注射BrdU后24h,在10%水合氯醛麻醉下,迅速断头取出脑组织,放入特制的小盒内,缓缓平放入盛有液氮的小杯中,当盒底接触液氮时即开始气化沸腾,10s~20s后脑组织迅速冰结成块,取出脑组织冰块立即置入-70℃冰箱中备用。
1.5 脑组织总RNA提纯分离 大鼠缺血再灌注后3d、5d、7 d和14d、21d、30d各组脑缺血侧、缺血对侧区脑组织,以及通心络治疗后缺血侧脑组织,提取总RNA。进行RT-PCR及半定量分析,以2% 琼脂糖-TBE凝胶电泳,凝胶成像系统成像;采用gel pro软件分析,以目的片段与β-actin的光密度比值(D)作为目的片段mRNA的相对含量,分离PCR产物,以DL-2000Marker为参照物。
引物设计:参考Genbank核普酸序列资料,应用Oligo5.0软件程序设计有意义引物,由北京赛百盛基因技术有限公司合成纯化。其具体设计如下:
2 结 果
2.1 脑组织总RNA的提取结果 二条分别代表RNA的18 s,28s清晰条带,电泳图谱28s和18s酶比值约为2∶1,说明实验中的RNA完整无降解。
2.2 缺血再灌注模型组与通心络组VEGF mRNA表达 假手术组几乎检测不到VEGF mRNA的表达;大鼠脑缺血再灌注后在病灶对侧仅见少量VEGF mRNA表达;缺血再灌注模型组及通心络组病灶侧VEGF mRNA在不同时间段均有表达,并随时间延长其表达增加,第5、7天最高,第14天时表达开始下降,但通心络组同一时间点VEGF mRNA的表达均较模型组增强。
3 讨 论
缺血性脑损伤后,动脉血管闭塞而致局部脑血流减少,脑组织缺血、缺氧,产生神经组织损伤。缺血半暗带的理论是由Astrup等1981年根据动物实验首次提出的,此区域存在侧支循环,部分血流可供应此区域,尚有大量神经元存活,如果血液迅速恢复,脑代谢得以改善,损伤仍然可逆,神经细胞仍可存活并恢复功能,这种可逆性取决于血管的新生和侧支循环的形成。脑缺血再灌注损伤时,VEGF可通过与其受体结合而促进血管内皮细胞的增殖,加速新生血管的形成,提高血管通透性,并以自分泌、旁分泌和胞内分泌的方式特异地作用于血管内皮细胞受体,促进内皮细胞生长、增殖、迁移、细胞外基质降解、血管管型结构形成[3]。
缺血半暗带在缺血性脑损伤后虽然有神经功能的缺失,但仍有潜在的存活能力,神经细胞仍可存活并恢复功能,因此,急性脑梗死治疗的关键是保护这些可逆性的神经元。有研究发现[4],VEGF促进梗死区周围血管侧支循环的建立,改善了血流动力学状况和疾病预后。在新生血管生成方面VEGF及其受体具有特异性,因此在缺血性脑损伤中,研究VEGF及其受体对神经细胞保护作用已成为目前国内外研究的热点。VEGF参与许多中枢神经系统疾病,包括中风、脑缺血的神经保护。最近的研究表明,VEGF增强缺血后的神经再生[5]。缺血或缺氧可促使VEGF及其受体的mRNA和蛋白表达、生物活性均增加[6]。本实验提示,缺血损伤组在术后第3天即可检测到VEGF的表达,第5天达到高峰,第14天VEGF的表达开始下降,第30天恢复到基线水平;而假手术组几乎检测不到VEGF的表达,从而证实了缺血性脑损伤诱导了VEGF的表达。
祖国传统医学将本病归属于缺血性中风的范畴,国家中医药管理局脑病急症协作组将中风病定位在脑和脑脉,指出缺血性中风的病机是脑脉痹阻,与致病因素瘀最为紧密,因此治疗此病的方法为活血化瘀药,通过活血、疏通血脉、祛痰通络从而达到治疗目的。通心络胶囊是目前临床上治疗缺血性脑血管病的常用药物,在治疗缺血性脑血管疾病中己经取得了显著疗效;但其作用机制及作用靶点尚不完全清楚。本研究以通心络为干预因素,观察VEGF在通心络组及缺血对照组中变化,结果显示:通心络能够促进神经功能的恢复,降低缺血后神经功能的评分,使VEGF mRNA表达明显增加,从而推断通心络胶囊能够激活神经干细胞的增殖或者分化,促进VEGF基因的表达,这可能是通心络胶囊治疗缺血性脑血管疾病的机制之一。
VEGF表达的调控可能涉及多种机制,包括受一系列激素、生长因子和细胞因子的调节,受一些癌基因、抑癌基因的表达产物调节,特别是缺血、缺氧的刺激作用[7],缺血性脑损伤通过诱导VEGF的表达而发挥血管生成和神经保护的作用。本实验提示,通心络可能通过促进VEGF大量表达,使新生血管的形成增加及侧支循环的建立,降低了神经功能的缺失,这为临床运用通心络治疗缺血性脑血管病提供了有利的证据。本实验还观察到,在各时间点缺血对照组VEGF基因表达水平均低于通心络组,通心络组5d后VEGF mRNA开始增加,晚于缺血对照组,在以后的各时间点观察值均高于缺血对照组,一直持续到第30天;而对照组VEGF mRNA表达已回归至基线水平。因此,推断通心络中的某种成分可能促进了细胞表达VEGF或者表达该基因的细胞增加,但其具体机制还不清楚。本实验仅研究了通心络在基因水平对VEGF mRNA表达的影响,对于其在蛋白水平的表达尚未涉及;具体通心络中何种成分发挥作用,以及其作用机制如何尚有待进一步的探讨。
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