固态发酵豆粕蛋白质品质评价指标的研究

单达聪 王四新 季海峰 刘 辉

（北京市农林科学院畜牧兽医研究所，北京 100097）

经过微生物固态发酵的豆粕其物质成分发生了很大的变化，检测指标很多，概括起来包括感官指标、技术指标、安全指标和卫生指标。单纯从技术指标就有很多，全面检测非常费时费力，也难以应用到实际生产的产品质量评价标准中。因此确定关键性的少数技术指标用于发酵豆粕品质的快速评价是非常重要的研究内容。固态发酵豆粕的主要目的是钝化或消除其抗营养因子，其中最主要的是通过发酵处理降解蛋白质类抗营养因子，如7S和11S蛋白、胰蛋白酶抑制因子、大豆凝集素，使之失去抗营养作用。同时，在降解大分子蛋白质的过程中还可以积累大量的肽和游离氨基酸，从而提高豆粕蛋白质的消化吸收率和动物健康水平。但在发酵过程中部分氨基酸会被脱羧酶和氨基转移酶分解，积累一定量的胺类等含氮物，而降低豆粕的饲用价值。在发酵豆粕应用于仔猪日粮实践中，曾出现仔猪腹泻增多、生长性能下降等负面情况也证明了这一点。固态发酵豆粕生产工艺中，不同生产批次间品质不稳定性影响饲养效果，且表现突出，因此发酵豆粕品质的批次检验评价尤为重要。目前鲜见发酵豆粕品质评价关键技术指标的研究报道。以发酵豆粕含氮物检测指标间的相关性及其与饲养效果的关系两个角度，开展两个试验进行相关研究，为确定发酵豆粕简单、准确的技术评价指标提供科学依据。

试验一：发酵豆粕检测指标相关性研究。

1 材料和方法

1.1 菌种和豆粕

米曲霉（Aspergillus oryzae），孢子干粉制剂，孢子含量≥5×109个/g。

枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），干粉制剂，活菌数≥2×1010cfu/g。

酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，干粉制剂，活菌数≥2×1010cfu/g。

豆粕，普通豆油生产工艺生产的带皮豆粕，粗蛋白含量44%。

1.2 设施、设备与仪器

发酵温室；不锈钢发酵曲盘、可密封塑料袋；全自动定氮仪、酸度计、高效液相色谱仪、分析天平。

1.3 试验设计与操作方法

以最常用的发酵菌种和发酵方式组合，获得不同蛋白质水解度的样品，研究豆粕蛋白质降解各项指标的相关性。具体发酵处理方法见表1。

表1 固态发酵豆粕处理工艺参数

采用固态浅盘发酵工艺，好氧与厌氧结合连续进行。8个处理，3次重复共24个样品，每样品风干基础豆粕2000 g，干粉菌种接种量0.3%，加水量料水比1：0.8。接种、加水、混合均匀后装入不锈钢浅盘加透气盖，置30℃温室好氧发酵结束时，混合均匀后转入塑料袋排气密封，置于38℃温室，厌氧发酵与酶解。总时间达到18 h后结束发酵，检测样品。

1.4 检测指标与方法

总氮（TN，%）和粗蛋白（CP,%）含量采用食品安全国家标准《食品中蛋白质的测定GB/T 5009.5—2010》第一法中的自动凯氏定氮仪法；

挥发性盐基总氮（TVBN，mg/100 g），半微量凯氏定氮法；

游离氨基酸（FAA，%）和总氨基酸（TAA，%）含量测定采用高效液相色谱法（HPLC法）；

酸溶蛋白（TCA－SP,%）和肽含量(%)，采用国家标准《大豆肽粉GB/T 22492—2008》方法。

1.5 相关系数计算方法

相关系数计算采用Mcrosoft Excel XP的数据分析功能进行。

2 结果与分析

发酵豆粕品质的稳定性是保证饲养效果的重要内容，实际生产中出现的问题，由于不同工艺参数和不同批次造成产品饲养效果差异很大的现象屡见不鲜。从表2可见，试验设置的发酵工艺参数的不同对豆粕蛋白质降解技术指标形成了系列梯度，其中挥发性盐基氮、游离氨基酸和蛋白质水解度指标系列的变异系数很大，分别为116.2%、97.6%和35.2%；但酸溶蛋白质和肽含量的变异系数较小，分别为20.1%和13.1%，而粗蛋白质含量和总氨基酸含量的变异系数很小，分别为1.5%和4.5%。从不同的发酵工艺参数和批次影响发酵豆粕品质稳定性的角度看，变异系数较大的指标更适合用于其品质的评价，显然TVBN、FAA、DH更适合，而CP和TAA则不是重点。从营养和免疫技术的角度看，肽含量是很重要的指标，但其变异系数较小而相对稳定，也就是说其检测的重要性处于中等水平。

各指标间的变化趋势是否相同或相关是简化检测指标的重要方法。各指标间的相关系数见表3。

表2 发酵豆粕蛋白质水解指标检测结果

表3 发酵豆粕蛋白质水解度及其产物含量相关系数

分析表3可见，发酵豆粕蛋白质水解度与盐基氮含量、酸溶蛋白含量、游离氨基酸含量均呈现高度正相关，相关系数分别为 0.9611、0.8184、0.9533，均为极显著正相关（P＜0.01）；但与粗蛋白质含量、肽含量和总氨基酸含量则呈现较低的正相关，均没有达到显著水平（P＞0.05）。可见，随蛋白质水解度提高，豆粕中蛋白质类抗营养的大分子物质被水解为小分子时，累积的蛋白质水解产物，如酸溶蛋白质、游离氨基酸和盐基氮随之显著增加；但粗蛋白质、总氨基酸和肽含量不一定随之增加或稳定在某一基本水平，其中粗蛋白质含量稳定在50%左右，总氨基酸含量稳定在46%左右，肽含量变化稍大（4.17%～6.03%）。

试验二：蛋白质水解度和挥发性盐基总氮对仔猪饲养效果的影响

1 材料与方法

1.1 试验材料

将5种不同蛋白质水解度和盐基氮含量的豆粕作为试验材料。①普通豆粕，惠福粮油集团有限公司生产，DH=2.24%，TVBN=10.4 mg/100 g；②发酵豆粕A，DH=4.70%，TVBN=186.0 mg/100 g；③发酵豆粕 B，DH=22.20%，TVBN=519.0 mg/100 g；④混合豆粕 A，即发酵豆粕A与普通豆粕1：1比例的均匀混合物，DH=3.47%，TVBN=98.2 mg/100 g；⑤混合豆粕 B，即发酵豆粕B与普通豆粕1：1比例的均匀混合物，DH=12.22%，TVBN=264.7 mg/100 g。DH和TVBN的检测方法同试验一。

1.2 试验动物与分组管理

试验动物为长大杂交一代35日龄断奶健康仔猪60头，体重相近，公母各半。随机分为5组，分别作为对照组和试验1、2、3、4组；每组 12头，分3圈饲养，每圈4头为一个重复。试验期35 d。网床圈栏，自由采食，自由饮水，舍温20～22℃。专人饲养，每天清扫卫生，记录喂量，观察腹泻。试验开始和结束称重，每周结料。

1.3 试验日粮组成

对照组仔猪日粮配方为：玉米60%、普通豆粕19%、麦麸6.0%、鱼粉5.0%、乳清粉4.0%、豆油2.0%、预混料4.0%。以试验材料②、③、④、⑤分别替代基础日粮配方中的普通豆粕，依次配制试验1、2、3、4组的仔猪日粮，并制成颗粒饲料。粗蛋白含量：对照组和试验 1、2、3、4 组分别为 17.5%、17.6%、17.8%、17.5%、17.5%。

1.4 检测指标与方法

日增重(g/d)：测定试验开始和结束时仔猪体重,增重总量与试验天数的比值即日增重；采食量(g/d)；饲料增重比(F/G)：耗料与增重的比值；腹泻率(DR，%)：每天清晨观测记录仔猪腹泻现象，1头1次记为腹泻1头日,仔猪腹泻头日数与试验猪总饲养日数的比值。

1.5 数据处理

采用SPSS13.0统计软件，进行方差分析和邓肯法多重比较。统计分析结果表示方法：均值±标准偏差；肩标字母表明均值差异比较结果，小写字母不同表示差异显著（P＜0.05）,大写字母不同表示差异极显著（P＜0.01）。

2 结果与分析

生产性能指标与腹泻率试验结果见表4。

表4 试验仔猪日增重、采食量、料重比及腹泻率

2.1 日增重

表4中试验组与对照组日增重比较，试验1～4组依次为 542、420、377、410 g/d，均高于对照组（343 g/d），分别提高58.0%、22.4%、9.9%、19.5%，其中试验1组极显著高于对照组（P＜0.01），可见发酵豆粕替代普通豆粕可提高仔猪日增重；试验组之间比较，试验1组高于试验 2组（542 对 420 g/d，P＜0.05），表明发酵豆粕A优于发酵豆粕B；试验3组均值低于试验4组(377对 410 g/d，P＞0.05)，表明当发酵豆粕和普通豆粕按1：1的比例混合使用时，发酵豆粕A和发酵豆粕B没有显著差异；试验1组极显著高于试验3组（542对377 g/d，P＜0.01），试验2组和试验 4组没有显著差异（420对410 g/d，P＞0.05）。综合上述结果可见：发酵豆粕优于未发酵豆粕；发酵豆粕蛋白质水解度过高会导致盐基氮过高，发酵豆粕与未发酵豆粕按1：1混合应用，两种情况均会降低发酵豆粕的饲养效果。

分析表5及图1，随豆粕蛋白质水解度提高仔猪日增重先提高后下降，呈现二次函数趋势，以DH=4.7%时日增重最高；从表5和图2可见，随着豆粕的盐基总氮含量的提高，日增重的变化同样呈现二次函数趋势，且与蛋白质水解度和日增重的关系方向相同，结合两指标的性质有理由认为：随着豆粕蛋白质水解度的提高，盐基总氮随之上升，仔猪的耐受性在盐基总氮达到186 mg/100 g时达极限，超过该值时日增重开始下降。

表5 仔猪日粮豆粕蛋白质水解度、挥发性盐基氮与日增重、料重比比较

图1 蛋白质水解度与日增重的关系

图2 盐基总氮与日增重的关系

2.2 采食量和料重比

比较表4中各组试验仔猪采食量，试验组1、2组比对照组分别提高32.2%、12.0%，表明发酵豆粕可提高采食量，但发酵豆粕A优于发酵豆粕B；试验3、4组与对照组基本持平（－4.0%、3.6%），将发酵豆粕与普通豆粕按1：1比例混合使用则效果降低。分析表4中的料重比，试验 1、2、3、4组均优于对照组，分别为（F/G）1.51、1.65、1.57、1.56 对 1.80，比对照组分别降低16.1%、8.3%、12.8%、13.3%，表明发酵豆粕可提高饲料利用率；试验1组、2组之间比较，发酵豆粕A优于发酵豆粕B（1.51对 1.65）。

2.3 腹泻率

从表4中可见，试验1、2、3、4组和对照组的全程腹泻率分别为(DR)5.3%、13.9%、12.5%、21.1%、24.3%，与对照组相比分别降低77.9%、42.7%、48.5%、13.3%，各试验组仔猪腹泻率均明显低于对照组，表明发酵豆粕可明显降低仔猪腹泻率。发酵豆粕A优于发酵豆粕B,表明发酵豆粕过高挥发性盐基总氮含量(186对519 mg/100 g)可导致腹泻率增加；试验1组和试验3组比较（5.3%对12.5%），试验2组和试验4组比较 (13.9%对21.1%),分别降低腹泻率57.6%和34.1%，表明发酵豆粕和普通豆粕按1：1混合使用同样可以降低仔猪腹泻率，但效果下降。

3 小结与讨论

蛋白质的功能活性与其分子结构和分子量存在直接关系，豆粕中蛋白质类抗营养因子的抗营养作用因为发酵水解而形成酸溶蛋白和游离氨基酸等产物，使其降低或消除。豆粕蛋白质水解度反映出蛋白质大分子水解为小分子或游离氨基酸的程度,该指标与发酵豆粕酸溶蛋白质含量具有极显著的正相关(r=0.8184,P＜0.01)，而肽含量与酸溶蛋白质含量存在显著的正相关（r=0.7184，P＜0.05），所以使用酸溶蛋白质含量指标评价发酵豆粕蛋白质品质时，既可以反映豆粕中抗原蛋白质和其它蛋白质抗营养因子被水解的程度，进而揭示了该类抗营养因子活性被消除的程度，同时又可一定程度上反映肽含量的高低，所以酸溶蛋白质含量是评价发酵豆粕品质的较好且重要的指标。从另一个角度看，随着蛋白质水解度的提高，水解产生的游离氨基酸单体被脱羧酶催化脱羧产生胺类化合物，盐基氮含量随之提高，因此过高的蛋白质水解度可能导致豆粕中原有氨基酸被破坏而降低饲养效果，同时过高的挥发性盐基氮还可能造成负面影响。

从对实际饲养效果的影响看，蛋白质水解度和盐基总氮含量交互影响仔猪的日增重等生产性能指标。蛋白质水解度过低和过高都会降低饲养效果，该指标适宜值的范围在3.47%～12.2%；试验结果表明，发酵豆粕盐基氮含量也直接影响到饲养效果，过高的盐基氮会降低仔猪的生产性能指标，该指标值的适宜范围应低于186 mg/100 g。受本饲养试验设置梯度的影响，具体蛋白质水解度（或酸溶蛋白质含量）和盐基氮含量的优化数据值应进一步研究。综合上述试验结果可见，酸溶蛋白质（或蛋白质水解度）和挥发性盐基总氮含量可以作为从正反两个方向评价发酵豆粕蛋白质品质及其对饲养效果的影响，因此可以选择这两个指标作为评价发酵豆粕蛋白质品质的主要指标。

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