河南周口番茄黄化曲叶病病原分子鉴定

胡京昂 ，刘雪霞 ，蔡雨惠 ，曹刚强 ，应芳卿

番茄黄化曲叶病 （Tomato yellow leaf curl disease，TYLCD）是威胁番茄生产的一种严重病害，发病的植株叶片边缘呈鲜黄色、卷曲，叶脉褪绿，叶肉变厚，叶片变小，严重时植株矮化萎缩，一旦发生，番茄产量会受到很大的损失，严重时造成绝产。近几年该病在中国自南向北迅速传播蔓延，广东、江苏、安徽、山东、河北、河南、浙江、上海、北京、台湾等地均已有报道[1~9]。在国内大部分省市该病是由双生病毒科 （Geminiviridae）菜豆金色花叶病毒属（Begamovirus） 番茄黄化曲叶病毒 （Tomato yellow leaf curl virus，TYLCV）侵染引起。

TYLCV寄主主要是番茄、曼陀罗、辣椒、菜豆和烟草等，传毒介体为烟粉虱，同时可经嫁接传播，但不能经机械摩擦和种子传毒[10]。番茄黄化曲叶病毒病已经成为为害世界许多地区番茄生产的毁灭性病害，已给热带和亚热带地区很多国家的番茄生产造成严重损失。

2007年在黄河以南的扶沟县夏秋茬番茄和开封县、中牟县越冬温室番茄地里均发现典型黄化曲叶症状，且烟粉虱发生严重；2008年在黄河以北的内黄县也发生类似的症状；自2009年以来，除新野县以外，河南各番茄产区均有发生，主产区发生尤为严重。为了明确引起河南省番茄黄化症状的病毒种类及其起源变异，2011年秋季我们在病区采集病样，并对其部分基因组进行了克隆和分析，结果表明，引起河南省番茄黄化曲叶症状的病原为番茄黄化曲叶病毒，这是该病毒病在河南地区发生的首次分子检测报道。

1 材料与方法

1.1 试验材料

病样采集：2011年秋季在周口地区采集具有黄化曲叶病毒病典型症状，植株矮化、叶片卷曲、叶色褪绿、叶片增厚、具黄化症状的番茄叶片，-80℃保存备用，编号为HN-ZK。

菌株与载体：大肠杆菌DH5a、pMD18-T载体均购自宝生物（大连）有限公司。

1.2 叶片总DNA提取

利用CTAB法提取番茄叶片总DNA，取0.1 g番茄叶片样品，液氮中充分研磨，转入1.5 mL离心管，加入600μL 65℃ 预热的3%CTAB抽提缓冲液 （3%CTAB，200 mmol/L Tris-HCl，140 mmol/L NaCl，40 mmol/L EDTA，0.2%巯基乙醇)， 混匀后于65℃ 温育 30 min，再用 600 μL 氯仿/异戊醇（24∶1）抽提两次后，上清液中加入等体积的异丙醇，经异丙醇沉淀后，取沉淀经70%乙醇洗涤，干燥后溶于TE中，于-20℃保存备用。

1.3 PCR扩增、克隆和序列分析

根据双生病毒共同区及外壳蛋白基因保守序列设计简并引物 PA/PB[11]。 PA：5′-TAATATTACCKGWKGVCCSC-3′，PB：5′-TGGACYTTRCAWGGBCCTTCACA-3′（K=G 或 T；W=A 或 T；V=A，C 或G；S=C 或 G；Y=C 或 T；R=A 或 G；B=C，T 或 G），扩增双生病毒基因间隔区和部分外壳蛋白基因约500 bp的特异片段，并进行克隆和序列测定，上述引物由北京赛百盛生物技术有限公司合成。

PCR反应体系：10×PCR反应缓冲液 2.5μL，dNTPs 1.0 μL （2.5 mmol/L），PA/PB 引物各 1.0 μL（100 ng/μL），Taq 酶 0.2 μL （5 U/μL）， 模板 DNA 1.0μL，加ddH2O至总体积25μL。PCR反应条件：94℃预变性3 min，按下列条件进行 30个循环（94℃变性 45 s，50℃复性 45 s，72℃延伸 1 min），72℃延伸10 min。取5μL PCR产物，加入loading buffer和Gene Finder后，用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，在可见光透视仪上显示电泳结果。经杭州博日科技有限公司的胶回收试剂盒纯化约500 bp PCR产物，把纯化后的PCR产物克隆到pMD18-T载体（TaKaRa），阳性克隆经验证后送北京三博远志生物技术有限公司测序。

1.4 序列分析

获得的DNA序列用DNAMAN Version 4.0进行处理和分析，根据相似性明确病毒种类，进化树构建采用Mega 4.0的临近相邻法 （Neighbor-joining）。序列比对和进化分析中所用病毒（分离物）有：番茄黄化曲叶病毒廊坊分离物 （TYLCV-Langfang；JF833036），番茄黄化曲叶病毒浙江分离物 （TYLCV-ZJHZ12；FN256256），中国番茄黄化曲叶病毒四川分离物（TYLCV-SC65A-3；GU199588），中国番茄黄化曲叶病毒广西分离物 （TYLCV-CHI；AF311734），广东番茄黄化曲叶病毒广东分离物（TYLCGDV-G3；AY602166），番茄黄化曲叶病毒安徽分离物（TYLCV-AH-HB1；FN650807），番茄黄化曲叶病毒江苏分离物 （TYLCV-JSNJ1；FN256259），番茄黄化曲叶病毒北京分离物 （TYLCV-Beijing3；GU983859），番茄黄化曲叶病毒上海分离物（TYLCV-sh10；EU031444）。

2 结果与分析

2.1 PCR检测结果

以提取的番茄叶片DNA为模板，用通用引物PA/PB进行PCR检测，从HN-ZK样品中扩增出约500 bp的特异性条带（图1），结果表明，河南周口种植的番茄被烟粉虱传播的双生病毒侵染。

2.2 序列分析

图1 PCR检测结果M：DL1000 DNA Marker；1：HN-ZK 样品

图2 双生病毒基因组DNA-A部分片段核苷酸序列系统进化树

将PCR得到的500 bp左右的条带回收并克隆测序，序列全长为539 bp，序列的GenBank登录号为JQ754307。获得的DNA序列用DNAMAN Version 4.0进行处理和分析，该序列与番茄黄化曲叶病毒分离物AH-HB1的序列相似性高达98.7%，与其他番茄黄化曲叶病毒分离物序列相似性均在97%以上，而与中国番茄黄化曲叶病毒和广东番茄黄化曲叶病毒分离物序列相似性均在75%以下，这表明样品HN-ZK已被番茄黄化曲叶病毒感染而导致番茄黄化曲叶病的发生。将样品双生病毒基因组DNA-A部分片段与其他9个具有代表性的双生病毒分离物核苷酸序列构建系统关系树（图2），结果显示，广东番茄黄化曲叶病毒、中国番茄黄化曲叶病毒和番茄黄化曲叶病毒分别在3个不同的分支，其中河南分离物与来源于安徽、上海、浙江、江苏、河北廊坊和北京的番茄黄化曲叶病毒分离物单独聚为一个小分支，河南分离物与安徽分离物亲缘关系相对较近。

3 结论与讨论

近几年，番茄黄化曲叶病在河南省各地相继暴发，特别是秋延后番茄，给我省的番茄生产造成了巨大的损害。本研究利用分子生物学技术，检测了河南周口番茄黄化曲叶病的病原，通过PCR、克隆测序发现，侵染周口番茄的双生病毒为番茄黄化曲叶病毒。鉴于该病在我国的传播基本呈现自南向北、自东向西的蔓延趋势，以及序列对比表明，河南分离物与安徽分离物序列相似性最高达到98.7%，从构建的系统进化树也可以看出，河南分离物与安徽分离物的亲缘关系最近，推测河南番茄黄化曲叶病毒可能来源于安徽。

双生病毒种类繁多，在上海、浙江、江苏、安徽和北京等省市多为番茄黄化曲叶病毒侵染引起，河南的番茄黄化曲叶病已经初步鉴定为番茄黄化曲叶病毒侵染，但本研究仅克隆测序了一个地区的病害样本，下一步将在河南各地采集病害样本，进行全面的检测和鉴定，彻底明确河南省内为害番茄的双生病毒种类和分布。

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