醋酸棉酚对异育银鲫生长性能、血清生化指标和棉酚残留的影响

蒋春琴 冷向军李小勤 季晓琳 施登科

(上海海洋大学水产与生命学院，农业部淡水水产种质资源重点实验室，上海 201306)

棉酚又称棉毒素或棉籽醇，是棉籽色素腺体中的黄色多酚型色素，按存在形式可分为结合棉酚和游离棉酚。结合棉酚无毒性，在动物消化道内大部分不被吸收而排出，小部分则会在体内分解成游离棉酚。游离棉酚有毒性，主要由其所含的活性醛基和活性羟基产生毒性，不仅对心脏、肝脏、肾脏等实质性器官及神经、血管有毒害作用，而且能与棉籽蛋白中赖氨酸的ε－氨基(ε-NH2)发生美拉德反应，降低其营养价值。由于棉籽粕在水产饲料中的应用较广，因此研究游离棉酚对水产动物的影响具有重要的意义。目前，有关游离棉酚对水产动物毒害作用方面的研究较少。富惠光等［1］研究发现，罗非鱼和金鱼幼鱼摄食含0.1%醋酸棉酚(游离棉酚的一种存在形式)的饲料，生长未见异常;Lee等［2］报道，用棉籽粕完全替代鱼粉饲养虹鳟3年，未对其生长产生不利影响;Robinson［3］研究发现，在饲料中添加 25% ～30%低棉酚棉籽粕(游离棉酚含量为0.022%)，对斑点叉尾的生长无不良影响;姜光明等［4］研究得出，异育银鲫摄食含720 mg/kg醋酸棉酚的饲料，生长未受到抑制;Herman［5］认为，游离棉酚对虹鳟有很强的毒害作用，当摄食饲料游离棉酚含量达0.03%时，鱼体表现为食欲下降和生长不良;Barros等［6］研究发现，斑点叉尾摄食含55.0%棉籽粕(游离棉酚含量为671 mg/kg)的饲料后，其增重率显著下降。由此可知，水产动物因品种不同而对游离棉酚的敏感程度存在着较大差异。

本试验以异育银鲫为研究对象，在基础饲料中以醋酸棉酚的形式添加游离棉酚，旨在考察游离棉酚对异育银鲫生长性能、形体指标、肌肉成分、血清生化指标及棉酚残留的影响，为棉籽粕在水产饲料中的合理应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验饲料

在基础饲料中分别添加0(对照组)、300和900 mg/kg醋酸棉酚(均指纯醋酸棉酚含量，所用醋酸棉酚购于北京中棉紫光科技有限公司，纯度为98%)，配制成3种试验饲料。原料棉籽粕中游离棉酚含量为 674.15 mg/kg，小于 GB 13078—2001《饲料卫生标准》［7］规定的游离棉酚允许量(≤1 200 mg/kg)，基础饲料中棉籽粕含量为15.60%，实测游离棉酚含量为137.37 mg/kg。饲料原料均粉碎过40目筛，逐级混匀后再经制粒机加工成直径为1 mm的颗粒料，晾干备用。基础饲料组成及营养水平见表1。

1.2 试验动物与饲养管理

试验用异育银鲫购于上海市孙桥养殖场。选取平均体重为(31.68±0.01)g、体质健壮的试验鱼270尾，随机分为3组，每组3个重复，每个重复30尾。

饲养试验在上海海洋大学南汇特种养殖场进行，试验鱼以重复为单位饲养于水泥池(3.0 m×2.5 m ×1.2 m，水深 0.6 m)中，试验前驯化 1 周，待鱼摄食正常后开始试验。每日分别于08:30、12:30和16:30各投喂1次，投饲量为体重的3%～4%，并根据水温﹑天气﹑摄食情况进行调整。各组保持一致的投饲量，昼夜充气，定期换水。饲养试验期间，水温22～32℃，溶氧6.5～8.3 mg/L，pH 6.9 ～7.8，饲养时间为 8 周。

1.3 测定指标及方法

1.3.1 生长性能指标

试验结束后饥饿24 h，对鱼体进行称重，计算增重率、饲料系数、特定生长率和成活率。

1.3.2 形体指标

试验结束后饥饿24 h，每重复选取5尾鱼，用于测定体长体高比、肥满度、内脏指数和肝胰指数。

1.3.3 肌肉成分

试验结束后饥饿24 h，每重复选取3尾鱼，测定其肌肉中水分、灰分、粗蛋白质和粗脂肪含量。其中，水分含量采用105℃恒重法测定;灰分含量采用550℃灰化法测定;粗蛋白质含量采用凯氏定氮法测定;粗脂肪含量采用索氏抽提法测定。

1.3.4 血清生化指标

试验结束后饥饿24 h，每重复选取6尾鱼，尾静脉取血1 mL，6 000 r/min离心5 min得血清，于－20℃冰箱保存待测。其中，谷草转氨酶(GOP)和谷丙转氨酶(GPT)活性均采用比色法测定;碱性磷酸酶(AKP)活性采用一磷酸腺苷(AMP)缓冲液法测定;总蛋白(TP)含量采用双缩脲法测定;肌酐(CREA)含量采用改良JAFF法测定;尿素(UREA)含量采用紫外－谷氨酸脱氢酶法测定;总胆固醇(TC)和甘油三酯(TG)含量均采用氧化酶法测定;总胆红素(T-Bil)含量采用钒酸盐氧化法测定;葡萄糖(Glu)含量采用葡萄糖氧化酶法测定;钙(Ca)含量采用偶氮胂－Ⅲ法测定。上述指标均采用迈瑞BS－200全自动生化分析仪测定。

1.3.5 肌肉和肝脏游离棉酚含量

试验结束后饥饿24 h，每重复选取10尾鱼，对鱼体进行解剖，取肝脏及侧线以上2侧背肌，冷冻干燥处理后－20℃冰箱保存待测。游离棉酚含量采用GB 13086—1991《饲料中游离棉酚的测定方法》［8］中的苯胺比色法测定。

1.4 数据统计与分析

除成活率外，结果均以平均值±标准差表示，数据采用SPSS 16.0进行统计分析，用Duncan氏法进行多重比较，差异显著水平为P＜0.05。

2 结果

2.1 醋酸棉酚对异育银鲫生长性能的影响

由表2可知，随着醋酸棉酚添加量的增加，异育银鲫的增重率和特定生长率逐渐降低，而饲料系数则逐渐升高。与对照组相比，添加300 mg/kg醋酸棉酚组增重率降低了8.43%(P＜0.05)，特定生长率降低了5.82%(P＜0.05)，饲料系数升高了7.69%(P ＞0.05);添加 900 mg/kg醋酸棉酚组增重率降低了12.22%(P＜0.05)，特定生长率降低了 7.94%(P＜0.05)，饲料系数升高了14.69%(P＜0.05)。8周的饲养试验结束时，各组的成活率均为100%。

表2 醋酸棉酚对异育银鲫生长性能的影响Table 2 Effects of gossypol-acetic acid on growth performance of Carassius auratus gibelio

2.2 醋酸棉酚对异育银鲫形体指标的影响

由表3可知，随着醋酸棉酚添加量的增加，异育银鲫的肥满度逐渐降低，其中添加900 mg/kg醋酸棉酚组显著低于对照组(P＜0.05);而肝胰指数则逐渐升高，其中添加900 mg/kg醋酸棉酚组显著高于对照组和添加300 mg/kg醋酸棉酚组(P＜0.05)。异育银鲫的内脏指数随着醋酸棉酚添加量的增加呈降低趋势，但组间差异不显著(P＞0.05)。各组异育银鲫的体长体高比无显著差异(P ＞0.05)。

表3 醋酸棉酚对异育银鲫形体指标的影响Table 3 Effects of gossypol-acetic acid on physical indices of Carassius auratus gibelio

2.3 醋酸棉酚对异育银鲫肌肉成分的影响

由表4可知，醋酸棉酚添加量对异育银鲫肌肉水分、灰分、粗蛋白质和粗脂肪含量均未产生显著影响(P ＞0.05)。

表4 醋酸棉酚对异育银鲫肌肉成分的影响Table 4 Effects of gossypol-acetic acid on muscle composition of Carassius auratus gibelio %

2.4 醋酸棉酚对异育银鲫血清生化指标的影响

由表5可知，添加900 mg/kg醋酸棉酚组异育银鲫的血清谷草转氨酶、谷丙转氨酶活性和肌酐含量显著高于对照组(P＜0.05)，而血清碱性磷酸酶活性和总蛋白含量则显著低于对照组(P＜0.05);添加300 mg/kg醋酸棉酚组异育银鲫上述指标的值介于对照组与添加900 mg/kg醋酸棉酚组之间，与上述2组均无显著差异(P＞0.05)。各组异育银鲫的血清尿素、总胆固醇、甘油三酯、总胆红素、葡萄糖和钙含量无显著差异(P＞0.05)。

2.5 醋酸棉酚对异育银鲫肌肉和肝脏游离棉酚含量的影响

由表6可知，随着醋酸棉酚添加量的增加，异育银鲫的肌肉和肝脏游离棉酚含量逐渐增加。其中，添加300 mg/kg醋酸棉酚组肌肉和肝脏游离棉酚含量较对照组分别增加了14.87%(P＜0.05)和 26.23%(P ＜0.05);添加 900 mg/kg 醋酸棉酚组肌肉和肝脏游离棉酚含量较对照组分别增加了 30.57%(P ＜0.05)和 57.84%(P ＜0.05)。

3 讨论

3.1 醋酸棉酚对异育银鲫生长性能的影响

不同鱼类对于游离棉酚的敏感程度不同。Robinson 等［9］研究发现，罗非鱼(初重 1.0 g)摄食含0.1% ～0.2%醋酸棉酚的半纯合饲料后，其生长速度、饲料系数与对照组无显著差异;姜光明等［4］报道，异育银鲫摄食含醋酸棉酚720 mg/kg的饲料180 d后，其生长未受到抑制;Dorsa等［10］在斑点叉尾的试验中发现，饲料中游离棉酚含量小于0.09%时鱼体生长不受影响，当游离棉酚含量增加到0.12%时生长显著下降;曾虹等［11］以醋酸棉酚形式添加游离棉酚，当饲料中游离棉酚含量在400 mg/kg以上时，鲤鱼生长受到抑制，肝脏中棉酚蓄积量与饲料中游离棉酚含量呈正相关;Mediha等［12］研究发现，以含1 500 mg/kg 醋酸棉酚的饲料喂养斑点叉尾12周，鱼体增重率显著降低，部分个体出现停食现象。

表5 醋酸棉酚对异育银鲫血清生化指标的影响Table 5 Effects of gossypol-acetic acid on serum biochemical indices of Carassius auratus gibelio

表6 醋酸棉酚对异育银鲫肌肉和肝脏游离棉酚含量的影响(干物质基础)Table 6 Effects of gossypol-acetic acid on free gossypol content in muscle and liver of Carassius auratus gibelio(DM basis) mg/kg

本试验中，异育银鲫摄食添加300 mg/kg醋酸棉酚的饲料后，其增重率较对照组显著降低，当饲料中醋酸棉酚添加量增加到900 mg/kg时，鱼体增重率进一步降低，饲料系数进一步升高，肝胰指数则显著升高，说明游离棉酚对异育银鲫的危害表现明显，鱼体肝脏出现肿大现象。但在姜光明等［4］的试验中，异育银鲫摄食添加720 mg/kg醋酸棉酚饲料后，生长并未受到抑制。导致上述2个试验的结果不一致的原因可能在于:姜光明等［4］试验中鱼体生长较慢，养殖60 d时对照组增重率为53.01%，饲料系数为1.50;而本试验中养殖56 d时对照组增重率为187.4%，饲料系数为1.43。在饲料系数基本一致的情况下，低增重率意味着低采食量，低采食量意味着对游离棉酚的低摄入量，而低摄入量的游离棉酚可能在机体的代谢能力和耐受范围内，因而姜光明等［4］试验的饲料中添加720 mg/kg醋酸棉酚没有表现出对鱼体生长的抑制，而本试验的饲料中添加300 mg/kg醋酸棉酚却显著降低了鱼体增重率。此外，姜光明等［4］试验的基础饲料中没有棉籽粕，而本试验的基础饲料中含15.6%棉籽粕(137.37 mg/kg游离棉酚)。棉籽粕中的游离棉酚与以醋酸棉酚形式添加的游离棉酚是否具有不同的作用效果，值得进一步研究。

3.2 醋酸棉酚对异育银鲫血清生化指标的影响

谷草转氨酶和谷丙转氨酶作为评价肝功能的重要指标，可以反映肝脏的受损情况。蒋春琴等［13］研究发现，与游离棉酚含量为104.23 mg/kg的对照饲料相比，异育银鲫摄食游离棉酚含量为260.57 mg/kg的饲料，其血清谷草转氨酶和谷丙转氨酶活性分别增加了7.70%和16.78%。本试验中，当醋酸棉酚添加量为300 mg/kg时，血清谷草转氨酶和谷丙转氨酶活性变化不显著;而当醋酸棉酚添加量达到900 mg/kg时，血清谷草转氨酶和谷丙转氨酶活性显著升高，表明高剂量的醋酸棉酚可能使异育银鲫的肝功能受到了一定程度的损伤。

血清总蛋白常作为鱼体对环境应激因子反应的指示物［14］，血清碱性磷酸酶在生物体内直接参与磷酸基团的转移和代谢过程，在鱼体内的物质代谢和免疫防护中发挥重要作用［15］。本试验中，醋酸棉酚添加量为900 mg/kg时，异育银鲫的血清总蛋白含量与碱性磷酸酶活性显著降低，表明此添加量下的醋酸棉酚已对异育银鲫的健康造成了一定的负面影响，使机体代谢能力减弱或免疫调节功能下降。胆红素是血液循环中衰老红细胞在肝脏、脾脏及骨髓的单核－吞噬细胞系统中分解的产物，在肝脏内经过葡萄糖醛酸化的叫做直接胆红素，未在肝脏内经过葡萄糖醛酸化的叫做间接胆红素，二者的总和就是总胆红素［16］。若机体内生成的胆红素超过了肝细胞的处理能力，或者肝细胞的处理能力下降，以及胆红素排泄障碍等均会使得血清中总胆红素含量升高。本试验中，血清总胆红素含量随着饲料中醋酸棉酚添加量的增加呈升高趋势，说明饲料中醋酸棉酚的增加可能导致了肝细胞处理胆红素能力的减弱。

肾脏受损和肾功能降低时，会引起多种化学成分如尿素、肌酐、尿酸等物质在血液中沉积，产生多种疾病，因此肌酐和尿素是反映肾功能的重要指标。本试验中，异育银鲫的血清肌酐和尿素含量随着醋酸棉酚添加量的增加而升高，表明鱼体肾功能可能受到了一定程度的损伤。此外，本试验发现，异育银鲫的血清总胆固醇、甘油三酯、葡萄糖和钙含量在各组间无显著变化，说明900 mg/kg添加量的醋酸棉酚并未影响机体的糖类和脂类代谢。

3.3 醋酸棉酚对异育银鲫棉酚残留的影响

游离棉酚被动物摄入后，大部分在消化道中形成结合棉酚经粪便排出，小部分被吸收，主要分布于肝脏、肾脏和肌肉组织中，尤以肝脏中含量最高。Roehm 等［17］研究发现，用含250 mg/kg游离棉酚的饲料喂养虹鳟18个月，其肝脏游离棉酚含量较低，而当饲料游离棉酚含量为1 000 mg/kg时，其肝脏游离棉酚含量显著增加;Mediha等［12］报道，随着饲料中醋酸棉酚含量的增加，斑点叉尾肝脏游离棉酚含量呈线性增加，醋酸棉酚添加量为1 500 mg/kg时，肝脏游离棉酚含量为1 066.06 mg/kg(干物质基础);作者前期的研究表明，随着饲料中棉籽粕的用量从0增加到60%(游离棉酚含量从 0mg/kg增加到260.57 mg/kg)，异育银鲫肌肉和肝脏游离棉酚含量由0 mg/kg分别增加到36.04和409.39 mg/kg(干物质基础)［13］。本试验中，随着醋酸棉酚添加量的增加，异育银鲫的肌肉和肝脏游离棉酚含量也显著增加，但并没有出现死亡的现象，表明异育银鲫对游离棉酚有较强的耐受力。从本试验结果还可以看出，肝脏是游离棉酚残留的主要器官，残留量相对较大，而游离棉酚在肌肉中的残留量相对较低。在养殖生产中，棉籽粕在草食性、杂食性鱼类配合饲料中的用量一般为20% ～30%，游离棉酚在肌肉中的残留量不会太高，但从品质安全的因素考虑，商品鱼在上市前应饲以不含棉籽粕的饲料或停喂一段时间，以促进鱼体对游离棉酚的代谢，降低肌肉游离棉酚含量。

4 结论

本试验条件下，当饲料中醋酸棉酚添加量达300 mg/kg时，异育银鲫的生长性能降低，组织中棉酚残留量增加;当饲料中醋酸棉酚添加量达900 mg/kg时，异育银鲫的肝功能和肾功能还会受到损伤。

［1］富惠光，卢彤岩，叶继丹，等.棉酚对罗非鱼、鲤和金鱼血钾及肝肾器官的影响［J］.水产学报，1995，19(2):180－183.

［2］LEE K J，RINCHARD J，DABROWSKI K，et al.Long-term effectsofdietary cottonseed meal on growth and reproductive performance ofrainbow trout:three-year study［J］.Animal Feed Science and Technology，2006，126(1):93－106.

［3］ROBINSON E H.Improvement of cottonseed meal protein with supplement lysine in feeds for channel catfish［J］.Journal of Applied Aquaculture，1991，1:1－14.

［4］姜光明，蔡春芳，钱彩源，等.醋酸棉酚对异育银鲫生长、生理及组织结构的影响［J］.饲料研究，2009(12):61－65.

［5］HERMAN R L.Effects of gossypol on rainbow trout Salmo gairdneri Richardson［J］.Journal of Fish Biology，1970，2(4):293－304.

［6］BARROS M M，LIM C，KLESIUS P H.Effect of soybean meal replacement by cottonseed meal and iron supplementation on growth，immune response and resistance of channel catfish(Ictalurus puctatus)to Edwardsiella ictaluri challenge［J］.Aquaculture，2002，207:263－279.

［7］中华人民共和国农业部.GB 13078—2001饲料卫生标准［S］.北京:中国标准出版社，2001.

［8］中华人民共和国国家技术监督局.GB/T 13086—1991饲料中游离棉酚的测定方法［S］.北京:中国标准出版社，1991.

［9］ROBINSON E H，RAWLES S D，OLDENBURG R W，et al.Effects of feeding glandless or glanded cottonseed products and gossypol to Tilapia aurea［J］.Aquaculture，1984，38:145－154.

［10］DORSA W J，ROBINETTE H R，POE W E.Effect of dietary cottonseed meal and gossypol on growth of young channel catfish［J］.Transactions of American Fisheries Society，1982，111:651－655.

［11］曾虹，任泽林，郭庆，等.棉酚在鲤鱼肝脏中的蓄排规律及对鲤鱼生长的影响［C］//中国水产学会水产动物营养与饲料研究会议论文集.北京:海洋出版社，1997:87－92.

［12］MEDIHA Y，CHHORN L，PETER J W，et al.Growth performance and immune response of channel catfish(Ictalurus puctatus)fed diets containing graded levels of gossypol acetic acid［J］.Aquaculture，2003，219:751－768.

［13］蒋春琴，冷向军，李小勤，等.饲料中菜粕和棉粕的不同配比对异育银鲫生长性能、血浆生化指标和棉酚残留的影响［J］.水产学报，2010，34(12):1917 －1924.

［14］童燕.盐度、pH和捕捞胁迫对史氏鲟生理生化影响的初步研究［D］.硕士学位论文.上海:华东师范大学，2007.

［15］黄周英，陈奕欣，赵扬，等.三丁基锡对文蛤鳃酸性磷酸酶、碱性磷酸酶和Na+，K+-ATP酶活性的影响［J］.海洋环境科学，2005，24(3):56 －59.

［16］王俊东，刘宗平.兽医临床诊断学［M］.北京:中国农业出版社，2004:237－239.

［17］ROEHM J N，LEE D J，SINNHUBER R O.Accumulation and elimination of dietary gossypol in the organs of rainbow trout［J］.The Journal of Nutrition，1967，92:425－428.