重组腺病毒Ad-hBNP的构建及其在CHF大鼠中的分布与表达

宋衍秋，赵莉莉，毛用敏*，赵鸿铭，徐美林，崔让庄

（天津市胸科医院1.天津市心血管病研究所;2.病理科，天津 300050）

重组腺病毒Ad-hBNP的构建及其在CHF大鼠中的分布与表达

宋衍秋1，赵莉莉1，毛用敏1*，赵鸿铭1，徐美林2，崔让庄1

（天津市胸科医院1.天津市心血管病研究所;2.病理科，天津 300050）

目的 构建重组腺病毒Ad-hBNP，观察其在CHF大鼠体内的分布与表达，为腺病毒介导BNP治疗慢性心力衰竭奠定实验基础。方法 RT-PCR法从人心肌组织获得hBNP片段，应用AdEasy腺病毒载体系统，构建Ad-hBNP;CHF成模大鼠24只，随机分为4组，18只单次腹腔注射Ad-hBNP后，均分为1、4和7 d组;余不予Ad-hBNP，为0点组。实验动物于相应时间处死，ELISA检测血清hBNP水平，免疫组化检测各脏器hBNP表达，RT-PCR检测各组织hBNPmRNA表达。结果 成功构建用于实验性基因治疗的Ad-hBNP，纯化后滴度达到4.4×1012VP/mL。透射电镜观察Ad-hBNP呈多面体结构，颗粒直径在90 nm左右。单次腹腔注射Ad-hBNP，CHF大鼠心脏、肝脏、肺脏、肾脏、脾脏及小肠均检测到hBNP表达，外源hBNP在CHF大鼠体内的表达至少可持续7天。结论 腺病毒介导的外源hBNP基因可在CHF大鼠多脏器中得到有效表达，其生物学效应时间显著长于BNP的生物半衰期。

B型利钠肽;腺病毒;慢性心力衰竭;基因治疗

*通信作者（corresponding author）:yongminmao@163.com

B型利钠肽 （B-type natriuretic peptide，BNP）是由左室肌细胞合成和分泌的一种肽类激素，其主要生理作用是:排尿利钠，参与水盐代谢;扩张血管，降低周围血管阻力;抑制肾素-血管紧张素-醛固酮系统;降低交感神经系统兴奋性;抗内皮细胞、平滑肌细胞、心肌细胞的有丝分裂，并抑制其增殖等［1］。慢性心力衰竭 （Chronic heart failure，CHF）是一种复杂的临床综合征，是多种心脏结构或功能疾病损伤心室充盈和 （或）射血能力的结果。近年CHF发病率不断增加，传统药物治疗效果欠佳。BNP的生物学作用满足了作为治疗心力衰竭药物的多项要求，已开始尝试应用于急性心力衰竭的治疗，但BNP的半衰期短暂，难达到稳定的治疗效果，探寻可以使BNP在体内持续存在的方法，对CHF的治疗具有重要的临床应用价值。本研究旨在构建Ad-hBNP，观察其在CHF大鼠体内的分布与表达，为腺病毒介导的hBNP治疗CHF奠定实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料

pUCm-T载体（上海生工生物技术服务有限公司）;AdEasy缺陷性腺病毒载体系统:穿梭质粒pAd-Track-CMV，骨架质粒pAdEasy-1（北京大学第一医院研究所）;E.coilBJ5183、E.coilDH5α（天津心血管病研究所）;HEK 293T细胞（ATCC公司）;限制性内切酶:KpnⅠ、SalⅠ、PmeⅠ、BamHⅠ和PacⅠ（MBI公司），高纯度质粒中量提取试剂盒［QIAGEN Plasmid Midi Kit（25）］、LipofectamineTMLTX 和plus Reagent（Invitrogen公司）;hBNP ELISA试剂盒（Adlitteram Diagnostic Laboratories，Lot No:RT110371）;免疫组织化学试剂:第一抗体鼠抗人BNP单克隆抗体（Santa Cruz Lot No:sc-101420），第二抗体 PV-9002（北京中杉金桥生物技术有限公司）;RNA提取试剂盒 RNAisoTM Plus［宝生物工程（大连）有限公司Cat No:D9108］。

1.2 方法

1.2.1 重组腺病毒Ad-hBNP的构建:RT-PCR方法从人心肌组织提取的RNA中获得hBNP扩增片段，与pUCm-T载体连接构建pUC-hBNP重组质粒;KpnⅠ和SalⅠ分别双酶切 pUC-hBNP和pAd-Track-CMV，将目的片段插入pAd-Track-CMV相应酶切位点，构建重组质粒pAdTrack-CMV-hBNP;pAdTrack-CMV-hBNP经PmeⅠ酶切线性化后，电转法转入含有腺病毒骨架质粒的E.coilBJ5183感受态细胞中，同源重组获得重组质粒 pAdEasy-hBNP;经BamHⅠ、PacⅠ酶切鉴定及基因序列检测后，重组成功的pAdEasy-hBNP经阳离子脂质体法转染HEK 293T细胞，经过包装、扩增和CsCl密度梯度超速离心法纯化后，A260法测定病毒滴度，电镜检测病毒形态。

1.2.2 构建CHF大鼠模型:清洁级Wistar雄性大鼠60只，8周龄，体质量250～300 g［中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心，许可证号:SCXK-（军）2007-004］。随机分为正常对照组（n=10）、假手术组（n=10）及腹主动脉缩窄术组（n=40）。术后予以肌肉注射青霉素4×107U，连续3 d，预防感染。术后12周通过超声心动图测定左室舒张末径（left ventrieular end diastolic dimension，LVEDD）、左室收缩末径（left ventricular end systolic dimension，LVESD）、左室射血分数 （left ventrieular ejection fraction，LVEF）、左室短轴缩短率（left ventrieular fractional shortening，LVFS）证明慢性心力衰竭造模成功，确定CHF入选标准，获得CHF成模大鼠，用于后续实验。

1.2.3 动物分组及给药方式:筛选CHF成模大鼠24只，随机均分为4组，每组6只，其中18只单次腹腔注射2.5×1010VP/mL NS重组腺病毒Ad-hBNP 1 mL，为 1（D1）、4（D4）和7 d组（D7）;另 6 只CHF大鼠不予以重组腺病毒，记为0点组（D0）。

1.2.4 CHF大鼠血清 hBNP水平检测:采用ELISA竞争性酶联免疫分析法检测各组实验大鼠血清hBNP水平。具体步骤参照hBNP ELISA试剂盒说明书。

1.2.5 CHF大鼠多脏器hBNP表达测定:免疫组化染色检测各组CHF大鼠心脏、肺脏、肝脏、脾脏、肾脏及小肠hBNP的表达。标本常规固定、包埋、切片，免疫组织化学染色，严格按照所购抗体说明书操作，第一抗体稀释度1∶50，DAB法显色。

1.2.6 RT-PCR法检测CHF大鼠各脏器hBNPmRNA的表达:采用Trizol法提取各组CHF大鼠心脏、肺脏、肝脏、脾脏、肾脏及小肠各脏器总 RNA。反转录获得各脏器cDNA。hBNPmRNA引物:上游5'-CTGCGGCCGCATGGATCCCCAGAC-3'，下游 5'-C TGCAGCCAGATCTTCCTCTTAATGCCG-3'。PCR扩增条件:95℃，预变性5 min;95℃，变性30 s;50℃，退火30 s;72℃，延伸1 min，扩增35个循环，72℃，延伸7 min。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳观察目的条带。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 重组腺病毒Ad-hBNP的构建

Ad-hBNP滴度为4.4×1012V P/mL。电镜下Ad-hBNP颗粒呈多面体结构，颗粒直径为80～90 nm左右（图1）。

图1 Ad-hBNP电镜图Fig 1 The electron micrograph of Ad-hBNP

2.2 建立CHF大鼠模型

与正常对照组及假手术组比较，模型组大鼠LVEDD及LVESD均增大，LVEF及LVFS均降低（P＜0.05，P＜0.01）（表1）。可见采用腹主动脉缩窄术法能够建立CHF大鼠模型。为确保下一步动物实验研究的可靠性，制定CHF大鼠的入选标准:LVESD ＞3.20 mm，LVEDD＞6.50 mm，LVEF＜75%，LVFS＜40%。筛选CHF大鼠24只，用于后续实验。

2.3 CHF大鼠血清hBNP随时间的变化

给药后第1天，hBNP水平明显增高，持续至第4天达顶峰，第7天回落（P＜0.01）（图2）。

图2 CHF大鼠血清hBNP随时间变化趋势Fig 2 hBNP serum levels of CHF rats in each group

2.4 CHF大鼠各脏器hBNP免疫组化检测

D1、D4、D7组 CHF大鼠心脏、肺脏、肝脏、脾脏、肾脏及小肠组织切片免疫组化染色均显示有hBNP表达。hBNP在CHF大鼠的肺脏、脾脏表达量最高。心脏以血管（内皮、平滑肌）明显，部分心室肌纤维淡染，间质及外膜未着色。肝脏以血管内皮染色明显。肾脏染色主要集中于肾小体，其余部位不明显。小肠上皮细胞着色明显（图3）。

2.5 CHF大鼠各脏器hBNP mRNA的表达

D1、D4、D7 组，CHF 大鼠心脏、肺脏、肝脏、脾脏、肾脏及小肠均可扩增出hBNP特异条带，大小为434 bp，D0组未见hBNP特异条带（图4）。

表1 各组大鼠超声心动图检测指标Table 1 The echocardiographic parameters from each group（±s）

表1 各组大鼠超声心动图检测指标Table 1 The echocardiographic parameters from each group（±s）

＊P＜0.01 compared with concrol group;△P＜0.05，△△P＜0.01 compared with sham group.

LVEDD（mm） LVESD（mm） LVEF（%） LVFS（%）concrol 5.27±0.90 2.77±0.69 84.20±5.95 48.18±6.50 sham 5.94±0.67 3.28±0.42 82.90±3.32 46.52±3.89 CHF 7.45±1.05＊△△ 4.50±1.32＊△ 69.41±6.71＊△△ 34.81±4.96＊△△

3 讨论

BNP主要由左室肌细胞合成分泌［2］，其主要生理作用包括:排钠利尿，参与水盐代谢调节;扩张血管，减轻心脏前负荷，降低体、肺循环阻力，增加心输出量;抑制中枢和外周交感神经;抑制RAAS［3］。此外，BNP还对心肌细胞有直接的脂肪分解作用，拮抗血管组织的增生和纤维化［4］，对抑制心肌细胞肥大、防止心室重构也发挥一定的作用［5］。

BNP独特的生物学作用，满足了作为治疗心力衰竭药物的多项要求，至今已有多项大规模临床研究，如:VMAC，FU-SION 等［6-7］，表明 rhBNP 在改善急性失代偿性充血性心力衰竭患者的临床症状及血液动力学参数方面优于或等同于传统血管活性药物，且耐受性更好，然而由于BNP半衰期短暂，仅有20 min，相对限制了其应用，对于CHF的治疗作用更是尚无定论。基因治疗的出现，为BNP治疗心力衰竭提供了新途径。本实验选用腺病毒载体系统，构建Ad-hBNP，利用其免疫原性低，可感染分裂和非分裂期细胞，不整合至宿主细胞基因组，无致突变等优点，将外源性hBNP基因导入 CHF大鼠;由于BNP为循环作用激素，其靶器官分布广泛，因此选用腹腔注射全身给药的方式，观察外源hBNP在CHF大鼠体内的分布与表达。

研究结果表明，腹腔注射Ad-hBNP 24 h后CHF大鼠血清内即检测到hBNP，体现了腺病毒作为基因治疗载体系统表达外源基因效率高的特点。外源hBNP在CHF大鼠体内表达第4天达高峰，第7天与第1天水平相近，可见外源性hBNP表达至少可以持续7 d，弥补了BNP半衰期极短的缺陷，显著提高血药浓度维持时间，使其治疗CHF成为可能。此外，还观察了hBNP在CHF大鼠体内的分布，与文献报道腺病毒受体（CRA）在大鼠体内的分布范围基本一致。但实验结果显示hBNP于CHF大鼠脾脏内特异染色显著。Ad-hVEFG165在骨髓移植小鼠体内的分布与表达时也发现重组腺病毒于脾脏有较强的表达，并呈逐渐增强的趋势［8］。目前该结果尚无合理解释，机制有待进一步探讨。

本实验为BNP治疗CHF提供了实验基础，但目前腺病毒载体仍面临难于大规模生产、病毒污染、引起宿主免疫反应等诸多问题，需要进一步探索，继续寻找理想的基因治疗载体。

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Construction of recombinant adenovirus Ad-hBNP and its distribution/expression in CHF rats

SONG Yan-qiu1，ZHAO Li-li1，MAO Yong-min1*，ZHAO Hong-ming1，XU Mei-lin2，CUI Rang-zhuang1

（1.Tianjin Institue of Cardiovascular Disease;2.Pathology，Tianjin Chest Hospital，Tianjin 300050，China）

ObjectiveTo construct Ad-hBNP and to observe the distribution/expression ofhBNPgene in CHF rats.MethodsThe target genehBNPwas obstained by reverse transcription polymerase chain reaction from human heart.The pAd-hBNP was constructed through AdEasy system.Recombinant plasmid pAd-hBNP was packaged and amplified in 293T cells.Ad-hBNP used in gene therapy was prepared.Twenty-four CHF rats were randomly divided into 4 groups for detecting the serum levels of hBNP with ELISA，the expression ofhBNPwith RT-PCR and immunohistochemistry in different groups.ResultsAd-hBNP was successfully constructed and the titer of purified Ad-hBNP was 4.4×1012VP/mL.Recombinant adenoviruses were shown as polyhedron shape under electron microscopy.The expression ofhBNPgene was detected in CHF rats by intraperitoneal injection Ad-hBNP and it continued at least 7 days.ConclusionsAd-hBNP is successfully constructed by using AdEasy system.Exogenous hBNP is effectively expressed in CHF rats.Compared with the half life of BNP，the biological process is significantly extended.

B-type natriuretic peptide;adnovirus;chronic heart failure;gene therapy

R 541.61

A

1001-6325（2012）01-0031-05

2010-12-03

2011-06-08

天津市卫生局项目（07KY01）