复方苦参注射液对子宫内膜癌HEC-1B细胞Bcl-2/Bax、P27表达的影响*

张文谨，彭 瑶，连增林，靳 冉，李晋生，海丽娜

子宫内膜癌是妇科常见的恶性肿瘤，发病率仅次于子宫颈癌。大部分子宫内膜癌的发生与雌激素有关，分化好的腺癌雌激素受体阳性率高[1]。子宫内膜癌的治疗方法众多，中药具有一定的抗肿瘤作用。复方苦参注射液是目前临床应用比较广泛的肿瘤辅助治疗药物之一，对放化疗均有一定的增效减毒作用，但是缺乏其作用机制的深入研究。

本研究采用复方苦参注射液及其组方成分作用子宫内膜癌HEC-1B细胞，观察用药各组对HEC-1B细胞增殖作用的影响，初步探讨复方苦参注射液抗肿瘤作用机制，研究不同药物对Bcl-2/Bax、P27表达的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料 人子宫内膜癌HEC-1B细胞株（中国科学院上海细胞库），顺铂（北京中日友好医院），复方苦参注射液、单苦参注射液、单白土苓注射液（均由山西振东制药有限公司提供），DMEM培养基（美国Gibco公司），胎牛血清（FBS）（美国Gibco公司），Reverse Transcription System（美国Promega公司），Trizol Reagent（美国invitrogen公司），GoldView TM核酸染料、100 bp DNA Ladder，PCR反应体系（购于北京赛百盛基因技术有限公司）。

Mastercycler pros梯度PCR仪（德国Eppendorf公司），Molecular Imager Gel Doc（美国 Bio-Rad Laboratories公司），Inc、HERA cell 150恒温二氧化碳（CO2）培养箱（美国 Thermo Electron Corporation公司），Olympus倒置显微镜（日本Olympus Corporation公司）。

所用引物序列以专业引物设计软件Premier 5.0设计而成。ERα36、ERα66、GAPDH 引物由北京赛百盛基因技术有限公司合成。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养 HEC-1B细胞常规培养于含10%FBS的DMEM培养液中，放置于37℃、5%CO2饱和湿度的孵育箱中孵育，2.5%胰酶常规消化传代培养，实验时取对数生长期细胞。

1.2.2 MTT法检测细胞增殖 取对数生长期HEC-1B细胞，以0.25%胰酶消化后用DMEM培养基（含10%胎牛血清）制成单细胞悬液，以1×105个/mL细胞浓度接种于96孔培养板中，100 μL/孔。当细胞生长至70%~80%融合时，换成无血清培养液继续培养24 h，使细胞同步于静止期后分组[2]。一共分为5组：细胞对照组、阳性对照组（DDP）、复方苦参注射液组（FK）、苦参注射液组（K）、白土苓注射液组（B）。顺铂注射用粉针剂用生理盐水稀释后加DMEM培养基，设高中低3个剂量组，终浓度分别为5、2.5、1.25 μg/mL。复方苦参注射液加DMEM培养基稀释，终浓度为10%、5%、2.5%。各组药物浓度配比设计见表1。各用药组每个浓度均设5个平行孔，用药处理 24、48、72 h 后，加入四甲基偶氮唑蓝（MTT）继续培养4 h后，吸去每孔的液体，加入二甲基亚砜（DMSO）100 μL/孔，微振荡器上震荡 15 min，用双波长法（492 nm/630 nm）测出细胞对照组和各实验组的吸光度值[3]。本实验重复3次，按公式计算细胞生长抑制率（IR）：IR＝（1－实验组 OD/对照组 OD）×100%。

表1 各给药组药物终浓度配比表

1.2.3 RT-PCR法检测Bcl-2/Bax、P27表达水平取对数生长期细胞，先用无血清培养液培养24 h，使细胞处于静止期同步化后，分为5组：复方苦参注射液组（FK）、苦参注射液组（K）、白土苓注射液组（B）、顺铂注射液组（DDP）、空白对照组。药物配制方法同上，各组药物浓度设计见表2。加入各组药物继续培养48 h。

表2 各给药组药物终浓度配比表

按Trizol法提取细胞总RNA，紫外分光光度法测定提取的总RNA含量及纯度，按照逆转录试剂盒说明书将mRNA逆转录为cDNA，以三磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）为内参照，进行PCR反应。引物序列见表3。反应程序：Bcl-2（94℃变性5 min，94℃30秒，58℃ 30秒，72℃ 1 min，72℃延伸 5 min，共35个循环）；Bax（94℃变性 150 s，94℃ 40秒，63℃40秒，72℃40 s，72℃延伸7 min，共30个循环）；P27（94℃变性 5 min，94℃ 30秒，55℃ 30秒，72℃1 min，72℃延伸5 min，共 35个循环）；GAPDH（95℃变性 5 min，94℃1 min，55℃ 1 min，72℃ 1 min，72℃延伸7 min，共30个循环）。

反应结束后以含有GoldView TM核酸染料的1.5%的琼脂糖凝胶电泳。在紫外光凝胶成像分析系统下摄片，以Bcl-2/Bax、P27基因片段与GAPDH片段灰度值的比值作为其相应表达水平数值。实验重复3次。

表3 引物序列及其PCR产物长度

1.3 统计学分析 应用SPSS 18.0软件进行统计学分析，组间比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MTT法检测细胞增殖 结果表明，各组药物作用48 h后显示出对细胞的抑制作用，复方苦参注射液和苦参注射液低浓度对人子宫内膜癌HEC-1B细胞不但没有明显的抑制增殖作用反而出现轻微的促增殖作用，但随用药浓度的增加表现出抑制作用，并且该作用随着药物剂量的增加而逐渐增强，其作用呈浓度依赖趋势。白土苓注射液几乎不影响细胞生长，吸光度值与空白对照组比较，组间差异无统计学意义（P>0.05）。不同给药组组间比较差异有统计学意义（P<0.05），复方苦参注射液组对细胞抑制作用最强。各组细胞抑制率见图1。

图1 不同给药组对HEC-1B细胞抑制率

2.2 RT-PCR检测Bcl-2/Bax、P27的表达 从电泳图观察，FK、K、DDP组Bcl-2的表达较空白对照组明显减弱（P<0.05），而Bax、P27的表达量明显增强，组间差异有统计学意义（P<0.05）。见图2、图3。

图2 不同给药组对Bcl-2/Bax、P27 mRNA水平的影响

3 讨论

复方苦参注射液（岩舒）是以苦参、白土苓为主的两味中草药经现代技术加工制成，其功效为清热利湿、凉血解毒、散结止痛。临床多用于晚期癌症的辅助治疗，具有较好的辅助抗癌及缓解患者癌性疼痛的作用。近年来，大量临床研究证实，复方苦参注射液在放化疗中不仅能够增强机体免疫功能，而且具有增效减毒作用[4]。本研究证实了复方苦参注射液和苦参注射液能够抑制人子宫内膜癌HEC-1B细胞生长，且该作用呈剂量依赖关系。

Bcl-2基因家族是细胞凋亡的重要调节者，其成员通过调节线粒体外膜的通透性和完整性起重要调控作用。正常子宫内Bcl-2与Bax表达具有一定周期性，Bcl-2表达增殖期高于分泌期、Bax表达分泌期高于增殖期[5-7]，说明雌孕激素可能通过调节细胞凋亡与增殖来维持子宫内膜的正常生理功能。本研究结果显示，复方苦参注射液、苦参注射液均能有效抑制HEC-1B细胞Bcl-2基因mRNA水平的表达，但苦参并未见增加HEC-1B细胞Bax基因表达的作用，而复方苦参注射液在抑制Bcl-2表达的同时还可增加Bax基因表达，证明复方苦参注射液的抗肿瘤作用机制在于对Bcl-2/Bax表达的调控，诱导肿瘤细胞凋亡。

图3 不同给药组Bcl-2、Bax、P27相对表达量

P27基因是一种调控细胞周期并抑制细胞分裂的重要基因，定位于第12号染色体短臂1区3带（12p13），其编码的蛋白P27kip1是一种非特异性多功能周期素依赖性激酶抑制剂（CDKI），通过抑制cyclin-CDK复合物的生物活性来调控细胞周期，最终导致肿瘤细胞在G1/S期停滞[8]。研究发现P27在子宫内膜增殖过程中起到调控作用，其表达缺失是发展为子宫内膜癌的重要一步。本研究结果显示复方苦参注射液和苦参注射液均有增加子宫内膜癌HEC-1B细胞P27基因mRNA水平表达，证明复方苦参注射液对HEC-1B细胞抑制作用还依赖于对细胞周期的影响[9]。

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